Dihydrofolátreduktáza - Dihydrofolate reductase

Dihydrofolátreduktáza
Krystalová struktura kuřecích jater dihydrofolátreduktázy. Vstup PDB 8dfr
Identifikátory
EC číslo	1.5.1.3
Číslo CAS	9002-03-3
Databáze
IntEnz	IntEnz pohled
BRENDA	Vstup BRENDA
EXPASY	Pohled NiceZyme
KEGG	Vstup KEGG
MetaCyc	metabolická cesta
PRIAM	profil
PDB struktur	RCSB PDB PDBe PDBsum
Genová ontologie	AmiGO / QuickGO
Vyhledávání PMC článků PubMed článků NCBI bílkoviny

R67 dihydrofolátreduktáza
Struktura plazmem kódované dihydrofolátreduktázy s vysokým rozlišením E-coli. Vstup PDB 2gqv
Identifikátory
Symbol	DHFR_2
Pfam	PF06442
InterPro	IPR009159
SCOP2	1vif / Rozsah / SUPFAM
Dostupné proteinové struktury: Pfam   struktur / ECOD   PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj PDBsum shrnutí struktury

DHFR
Dostupné struktury PDB Hledání ortologu: PDBe RCSB Seznam id kódů PDB 1BOZ, 1DHF, 1 DLR, 1DLS, 1 DRF, 1HFP, 1HFQ, 1HFR, 1 KMS, 1KMV, 1MVS, 1MVT, 1 OHJ, 1 OHK, 1PD8, 1PD9, 1PDB, 1S3U, 1S3V, 1S3W, 1U71, 1U72, 1YHO, 2C2S, 2C2T, 2DHF, 2W3A, 2W3B, 2W3M, 3EIG, 3F8Y, 3F8Z, 3F91, 3FS6, 3GHC, 3GHV, 3GHW, 3GI2, 3GYF, 3L3R, 3N0H, 3NTZ, 3NU0, 3NXO, 3NXR, 3NXT, 3NXV, 3NXX, 3NXY, 3 NZD, 3OAF, 3S3V, 3S7A, 4 DDR, 4G95, 4KAK, 4KBN, 4KD7, 4KEB, 4KFJ, 4M6J, 4M6K, 4M6L, 4QHV, 4QJC
Identifikátory
Aliasy	DHFR, DHFRP1, DYR, dihydrofolátreduktáza
Externí ID	OMIM: 126060 MGI: 94890 HomoloGene: 56470 Genové karty: DHFR
Umístění genu (člověk) Chr. Chromozom 5 (lidský)[1] Kapela 5q14.1 Start 80,626,226 bp[1] Konec 80,654,983 bp[1]
Umístění genu (myš) Chr. Chromozom 13 (myš)[2] Kapela 13 C3 | 13 47,64 cM Start 92,354,726 bp[2] Konec 92,389,053 bp[2]
Genová ontologie Molekulární funkce • vazba methotrexátu • vázání kyseliny listové • aktivita dihydrofolát reduktázy • vazba na léky • Vazba NADPH • Vazba RNA • aktivita oxidoreduktázy • mRNA vazba • aktivita folát reduktázy • aktivita translačního represoru, vazba nukleových kyselin • sekvenčně specifická vazba mRNA • Vazba NADP Buněčná složka • cytosol • cytoplazma • mitochondrie • buněčná složka Biologický proces • odpověď na methotrexát • metabolický proces dihydrofolátu • jednokarbonový metabolický proces • regenerace axonů • regulace transkripce podílející se na přechodu G1 / S mitotického buněčného cyklu • metabolický proces tetrahydrofolátu • proces biosyntézy tetrahydrofolátu • pozitivní regulace aktivity syntázy oxidu dusnatého • metabolický proces kyseliny listové • proces biosyntézy tetrahydrobiopterinu • oxidačně-redukční proces • regulace odstraňování superoxidových radikálů • negativní regulace překladu Zdroje:Amigo / QuickGO
Ortology
Druh	Člověk	Myš
Entrez	1719	13361
Ensembl	ENSG00000228716	ENSMUSG00000021707
UniProt	P00374	P00375
RefSeq (mRNA)	NM_000791 NM_001290354 NM_001290357	NM_010049
RefSeq (protein)	NP_000782 NP_001277283 NP_001277286	NP_034179
Místo (UCSC)	Chr 5: 80,63 - 80,65 Mb	Chr 13: 92,35 - 92,39 Mb
PubMed Vyhledávání	[3]	[4]
Wikidata
Zobrazit / upravit člověka Zobrazit / upravit myš

Dihydrofolátreduktázanebo DHFR, je enzym to snižuje kyselina dihydrofolová na kyselina tetrahydrofolová, použitím NADPH tak jako dárce elektronů, které lze převést na druhy tetrahydrofolátu kofaktory používá se v chemii přenosu 1-uhlíku. U lidí je enzym DHFR kódován DHFR gen.^[5][6]Nachází se v oblasti q11 → q22 chromozomu 5.^[7] Bakteriální druh mají odlišné DHFR enzymy (na základě jejich vzorce vazby diaminoheterocyklických molekul), ale savčí DHFR jsou velmi podobné.^[8]

Struktura

Centrální osm pramenů skládaný list beta tvoří hlavní rys polypeptid skládání páteře z DHFR.^[9] Sedm z těchto řetězců je paralelních a osmý probíhá antiparalelně. Čtyři alfa helixy připojte po sobě jdoucí řetězce beta.^[10] Zbytky 9 - 24 se nazývají „Met20“ nebo „smyčka 1“ a spolu s dalšími smyčkami jsou součástí hlavní subdomény, která obklopuje Aktivní stránky.^[11] The Aktivní stránky se nachází v N-terminál polovina sekvence, která zahrnuje a konzervovaný Pro -Trp dipeptid; the tryptofan bylo prokázáno, že je zapojen do vazby Podklad enzymem.^[12]

Funkce

Konvertuje dihydrofolátreduktáza dihydrofolát do tetrahydrofolát, protonový člun potřebný pro syntézu de novo puriny, kyselina thymidylová a jisté aminokyseliny. Zatímco funkční gen dihydrofolátreduktázy byl mapován na chromozom 5, bylo na samostatných chromozomech identifikováno několik intronless zpracovaných pseudogenů nebo genů podobných dihydrofolátreduktáze.^[13]

DHFR, který se nachází ve všech organismech, má zásadní roli v regulaci množství tetrahydrofolátu v buňce. Tetrahydrofolát a jeho deriváty jsou nezbytné pro purin a thymidylát syntéza, které jsou důležité pro buněčnou proliferaci a růst buněk.^[14] DHFR hraje ústřední roli při syntéze nukleová kyselina prekurzory a ukázalo se, že mutantní buňky, které zcela postrádají DHFR, vyžadují ke svému růstu glycin, aminokyselinu a thymidin.^[15] DHFR byl také prokázán jako enzym podílející se na záchraně tetrahydrobiopterinu z dihydrobiopterinu^[16]

Mechanismus

Redukce dihydrofolátu na tetrahydrofolát katalyzovaná DHFR.

Obecný mechanismus

DHFR katalyzuje přenos hydridu z NADPH na dihydrofolát s doprovodnou protonací k výrobě tetrahydrofolát.^[14] Nakonec se dihydrofolát redukuje na tetrahydrofolát a NADPH se oxiduje na NADP +. Vysoká flexibilita Met20 a dalších smyček v blízkosti aktivního místa hraje roli při podpoře uvolňování produktu, tetrahydrofolátu. Zejména smyčka Met20 pomáhá stabilizovat nikotinamidový kruh NADPH, aby podporoval přenos hydridu z NADPH na dihydrofolát.^[11]

DHFR (smyčka Met20) + NADPH + folát

Mechanismus tohoto enzymu je postupný a ustálený stav náhodný. Konkrétně katalytická reakce začíná NADPH a substrátem navázaným na vazebné místo enzymu, následovanou protonací a přenosem hydridu z kofaktoru NADPH na substrát. Dva poslední kroky však neprobíhají současně ve stejném přechodovém stavu.^[17][18] Ve studii využívající výpočetní a experimentální přístupy Liu et al k závěru, že krok protonace předchází přenosu hydridu.^[19]

Uzavřená struktura je v katalytickém schématu znázorněna červeně a uzavřená struktura je znázorněna zeleně. Ve struktuře jsou DHF a THF zabarveny červeně, NADPH zbarveno žlutě a zbytek Met20 modře

Ukázalo se, že enzymatický mechanismus DHFR je závislý na pH, zejména na kroku přenosu hydridu, protože se ukázalo, že změny pH mají pozoruhodný vliv na elektrostatiku aktivního místa a ionizační stav jeho zbytků.^[19] Kyselost cíleného dusíku na substrátu je důležitá při vazbě substrátu na vazebné místo enzymu, což se ukázalo jako hydrofobní, i když má přímý kontakt s vodou.^[17][20] Asp27 je jediný nabitý hydrofilní zbytek ve vazebném místě a neutralizace náboje na Asp27 může změnit pKa enzymu. Asp27 hraje kritickou roli v katalytickém mechanismu tím, že pomáhá s protonací substrátu a omezuje substrát v konformaci příznivé pro přenos hydridů.^[21][17][20] Ukázalo se, že protonační krok je spojen s tautomerizací enolů, i když tato přeměna není považována za příznivou pro darování protonu.^[18] Je prokázáno, že molekula vody je zapojena do protonačního kroku.^[22][23][24] Vstup molekuly vody do aktivního místa enzymu usnadňuje smyčka Met20.^[25]

Konformační změny DHFR

Katalytický cyklus reakce katalyzovaný DHFR zahrnuje pět důležitých meziproduktů: holoenzym (E: NADPH), Michaelisův komplex (E: NADPH: DHF), ternární produktový komplex (E: NADP⁺: THF), binární komplex tetrahydrofolátu (E: THF) a komplex THF ‚NADPH (E: NADPH: THF). Krok disociace produktu (THF) z E: NADPH: THF na E: NADPH je krok určující rychlost během obratu v ustáleném stavu.^[21]

Konformační změny jsou v katalytickém mechanismu DHFR zásadní.^[26] Smyčka Met20 DHFR je schopna otevřít, zavřít nebo uzavřít aktivní místo.^[23][17] Odpovídajícím způsobem jsou Met20 přiřazeny tři různé konformace klasifikované jako otevřené, uzavřené a uzavřené stavy. Kromě toho byla definována extra zkreslená konformace Met20 kvůli jeho nejasným výsledkům charakterizace.^[23] Smyčka Met20 je pozorována v uzavřené konformaci ve třech meziproduktech ligujících produkt, kde je nikotinamidový kruh uzavřen z aktivního místa. Tato konformační funkce odpovídá za skutečnost, že substituce NADP⁺ NADPH je před disociací produktu. Další kolo reakce tedy může nastat po navázání substrátu.^[21]

Porovnání kinetiky reakce mezi EcDHFR a R67 DHFR

Strukturní rozdíl vazby substrátu v E. coli a R67 DHFR

R67 DHFR

Díky své jedinečné struktuře a katalytickým vlastnostem je R67 DHFR široce studován. R67 DHFR je DHFR kódovaný R-plazmidem typu II bez genetického a strukturního vztahu k chromozomálnímu DHFR E. coli. Jedná se o homotetramer, který má symetrii 222 s jediným pórem aktivního místa, který je vystaven rozpouštědlu [null.]^[27] Tato symetrie aktivního místa vede k odlišnému způsobu vazby enzymu: Může se vázat se dvěma molekulami dihydrofolátu (DHF) s pozitivní kooperativitou nebo dvěma molekulami NADPH s negativní kooperativitou nebo jedním substrátem plus jeden, ale pouze ten druhý má katalytický aktivita.^[28] Ve srovnání s E. coli chromozomálním DHFR má vyšší K._m ve vazbě dihydrofolátu (DHF) a NADPH. Mnohem nižší katalytická kinetika ukazuje, že přenos hydridů je spíše krokem určujícím rychlost než uvolňování produktu (THF).^[29]

Ve struktuře R67 DHFR tvoří homotetramer póry aktivního místa. V katalytickém procesu vstupují DHF a NADPH do pórů z opačné polohy. Interakce skládání π-π mezi nikotinamidovým kruhem NADPH a pteridinovým kruhem DHF těsně spojuje dva reaktanty v aktivním místě. Po navázání však byla pozorována flexibilita p-aminobenzoylglutamátového konce DHF, což může podporovat tvorbu přechodového stavu.^[30]

Klinický význam

Nedostatek dihydrofolát reduktázy byl spojen s megaloblastická anémie.^[13] Léčba probíhá snížena formy kyseliny listové. Protože tetrahydrofolát, produkt této reakce, je u lidí aktivní formou folátu, může inhibice DHFR způsobit funkční nedostatek folátu. DHFR je atraktivní farmaceutický cíl pro inhibici díky své klíčové roli při syntéze prekurzoru DNA. Trimethoprim, an antibiotikum, zatímco inhibuje bakteriální DHFR methotrexát, a chemoterapie činidlo, inhibuje savčí DHFR. Nicméně, odpor se vyvinul proti některým lékům v důsledku mutačních změn samotného DHFR.^[31]

Mutace DHFR způsobují vzácnou autozomálně recesivní vrozenou chybu metabolismu folátu, která vede megaloblastická anémie, pancytopenie a těžké nedostatek mozkových folátů kterou lze opravit pomocí kyselina folinová doplnění.^[32][33]

Terapeutické aplikace

Vzhledem k tomu, že folát je nezbytný pro rychlé dělení buněk tymin lze tento účinek využít k terapeutické výhodě.

DHFR lze cílit při léčbě rakoviny a jako potenciální cíl proti bakteriálním infekcím. DHFR je zodpovědný za hladiny tetrahydrofolátu v buňce a inhibice DHFR může omezit růst a proliferaci buněk, které jsou charakteristické pro rakovinu a bakteriální infekce. Methotrexát, a kompetitivní inhibitor DHFR, je jedním z takových protinádorových léčiv, které inhibují DHFR.^[34] Mezi další léky patří trimethoprim a pyrimethamin. Tyto tři jsou široce používány jako protinádorová a antimikrobiální činidla.^[35] Jiné třídy sloučenin, které se obecně zaměřují na DHFR, a zejména bakteriální DHFR, patří do tříd, jako jsou diaminopteridiny, diaminotriaziny, diaminopyrrolochinazoliny, stilbeny, chalkony, deoxybenzoiny, abychom jmenovali jen několik.^[36]

Trimethoprim prokázal aktivitu proti různým látkám Grampozitivní bakteriální patogeny.^[37] Může však vzniknout rezistence na trimethoprim a další léky zaměřené na DHFR v důsledku různých mechanismů, které omezují úspěšnost jejich terapeutického použití.^[38][39][40] Rezistence může vzniknout amplifikací genu DHFR, mutace v DHFR,^[41][42] snížení absorpce drog, mimo jiné. Bez ohledu na to, trimethoprim a sulfamethoxazol v kombinaci se používá jako antibakteriální látka po celá desetiletí.^[37]

Folát je nezbytný pro růst,^[43] a cesta metabolismu folátu je cílem při vývoji léčby rakoviny. Jedním z takových cílů je DHFR. Režim fluorouracil, doxorubicin Bylo prokázáno, že methotrexát prodlužuje přežití u pacientů s pokročilým karcinomem žaludku.^[44] Další studie týkající se inhibitorů DHFR mohou vést k dalším způsobům léčby rakoviny.

Bakterie také potřebují k růstu a množení DHFR, a proto našli inhibitory selektivní pro bakteriální DHFR uplatnění jako antibakteriální látky.^[37]

Třídy malých molekul používaných jako inhibitory dihydrofolátreduktázy zahrnují diaminochinazolin a diaminopyrrolochinazolin,^[45] diaminopyrimidin, diaminopteridin a diaminotriaziny.^[46]

Potenciální léčba antraxu

Strukturální vyrovnání dihydrofolátreduktázy z Bacillus anthracis (BaDHFR), Zlatý stafylokok (SaDHFR), Escherichia coli (EcDHFR) a Streptococcus pneumoniae (SpDHFR).

Dihydrofolát reduktáza z Bacillus anthracis (BaDHFR) validovaný lékový cíl v léčbě infekční choroby, antraxu. BaDHFR je méně citlivý na trimethoprim analogy než je dihydrofolátreduktáza z jiných druhů, jako je např Escherichia coli, Zlatý stafylokok, a Streptococcus pneumoniae. Strukturální srovnání dihydrofolátreduktázy ze všech čtyř druhů ukazuje, že kombinaci má pouze BaDHFR fenylalanin a tyrosin v pozicích 96, respektive 102.

Odolnost vůči BaDHFR trimethoprim analogy je způsobeno těmito dvěma zbytky (F96 a Y102), které také propůjčují zlepšenou kinetiku a katalytickou účinnost.^[47] Současný výzkum využívá mutanty aktivního místa v BaDHFR k vedení optimalizace olova pro nové antifolátové inhibitory.^[47]

Jako výzkumný nástroj

DHFR byl použit jako nástroj k detekci interakce protein-protein v test komplementace proteinových fragmentů (PCA).

CHO buňky

DHFR chybí CHO buňky jsou nejčastěji používány buněčná linie pro produkci rekombinantních proteinů. Tyto buňky jsou transfektovaný s plazmid nesoucí dhfr gen a gen pro rekombinantní protein v jednom expresní systém, a poté podroben selektivní podmínky při nedostatku thymidinu střední. Přežívají pouze buňky s exogenním genem DHFR spolu s požadovaným genem.

Interakce

Bylo prokázáno, že dihydrofolátreduktáza interaguje s GroEL^[48] a Mdm2.^[49]

Interaktivní mapa cest

Kliknutím na geny, bílkoviny a metabolity níže zobrazíte odkazy na příslušné články.^{[§ 1]}

[[Soubor:

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

[[

]]

| {{{bSize}}} px | alt = Aktivita fluorouracilu (5-FU) Upravit ]]

Aktivita fluorouracilu (5-FU) Upravit

1. ^ Interaktivní mapu cest lze upravit na WikiPathways: „FluoropyrimidinActivity_WP1601“.

Reference

Další čtení

externí odkazy

• 1988 Nobelova přednáška v medicíně
• Proteopedia: Dihydrofolátreduktáza
• Přehled všech strukturálních informací dostupných v PDB pro UniProt: P00374 (Dihydrofolát reduktáza) na PDBe-KB.