Test komplementace proteinových fragmentů - Protein-fragment complementation assay

V oblasti molekulární biologie, a test komplementace proteinových fragmentů, nebo PCA, je metoda pro identifikaci a kvantifikaci interakce protein-protein. V PCA jsou sledované proteiny („návnada“ a „kořist“) kovalentně spojeny s fragmenty třetího proteinu (např. DHFR, který působí jako „reportér“). Interakce mezi návnadou a kořistními proteiny přivádí fragmenty reportérového proteinu do těsné blízkosti, což jim umožňuje vytvořit funkční reportérový protein, jehož aktivitu lze měřit. Tento princip lze aplikovat na mnoho různých reportérových proteinů a je také základem pro kvasnicový dvouhybridní systém, archetypální test PCA.

Stanovení split proteinu

Princip PCA
Obecný princip testu komplementace proteinů: protein je rozdělen na dvě (N- a C-koncové) poloviny a rekonstituován dvěma interagujícími proteiny, které jsou fúzovány s N a C polovinami (zde nazývané „návnada“ a „kořist“, protože protein návnady lze použít k nalezení interagujícího proteinu kořisti). Aktivita rekonstituovaného proteinu by měla být snadno zjistitelná, např. jako v zelený fluorescenční protein (GFP).

V PCA lze použít jakýkoli protein, který lze rozdělit na dvě části a nekovalentně rekonstituovat za vzniku funkčního proteinu. Tyto dva fragmenty však mají k sobě nízkou afinitu a musí být spojeny jinými interagujícími proteiny, které jsou k nim fúzovány (často nazývané „návnada“ a „kořist“, protože protein návnady lze použít k identifikaci kořistního proteinu, viz postava). Protein, který produkuje zjistitelný údaj, se nazývá „reportér“. Obvykle enzymy, které propůjčují rezistenci na nedostatek živin nebo antibiotika, jako je např dihydrofolát reduktáza nebo beta-laktamáza jako reportéry se používají proteiny, které dávají kolorimetrické nebo fluorescenční signály. Když jsou fluorescenční proteiny rekonstituovány, nazývá se PCA Test komplementace bimolekulární fluorescence. V PCA s rozdělenými bílkovinami byly použity následující proteiny:

Reference

  1. ^ Park JH, Back JH, Hahm SH, Shim HY, Park MJ, Ko SI, Han YS (říjen 2007). „Strategie komplementace fragmentace bakteriální beta-laktamázy může být použita jako metoda pro identifikaci interagujících proteinových párů“. Journal of Microbiology and Biotechnology. 17 (10): 1607–15. PMID  18156775.
  2. ^ Remy I, Ghaddar G, Michnick SW (2007). „Použití testu komplementace beta-laktamázový protein-fragment k testování dynamických interakcí protein-protein“. Přírodní protokoly. 2 (9): 2302–6. doi:10.1038 / nprot.2007.356. PMID  17853887.
  3. ^ Tarassov K, Messier V, Landry CR, Radinovic S, Serna Molina MM, Shames I, Malitskaya Y, Vogel J, Bussey H, Michnick SW (červen 2008). „Mapa in vivo interaktomu kvasinkového proteinu“ (PDF). Věda. 320 (5882): 1465–70. Bibcode:2008Sci ... 320.1465T. doi:10.1126 / science.1153878. PMID  18467557.
  4. ^ Ma Y, Nagamune T, Kawahara M (září 2014). "Split fokální adhezní kináza pro zkoumání interakcí protein-protein". Biochemical Engineering Journal. 90: 272–278. doi:10.1016 / j.bej.2014.06.022.
  5. ^ Barnard E, Timson DJ (2010). Split-EGFP obrazovky pro detekci a lokalizaci interakcí protein-protein v živých kvasinkových buňkách. Metody v molekulární biologii. 638. 303–17. doi:10.1007/978-1-60761-611-5_23. ISBN  978-1-60761-610-8. PMID  20238279.
  6. ^ Blakeley BD, Chapman AM, McNaughton BR (srpen 2012). „Split-superpositive GFP reassembly is a quick, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo“. Molekulární biosystémy. 8 (8): 2036–40. doi:10.1039 / c2mb25130b. PMID  22692102.
  7. ^ Cabantous S, Nguyen HB, Pedelacq JD, Koraïchi F, Chaudhary A, Ganguly K, Lockard MA, Favre G, Terwilliger TC, Waldo GS (říjen 2013). „Nový senzor interakce protein-protein založený na asociaci tripartitní split-GFP“. Vědecké zprávy. 3: 2854. Bibcode:2013NatSR ... 3E2854C. doi:10.1038 / srep02854. PMC  3790201. PMID  24092409.
  8. ^ Martell JD, Yamagata M, Deerinck TJ, Phan S, Kwa CG, Ellisman MH, Sanes JR, Ting AY (červenec 2016). „Štěpená křenová peroxidáza pro detekci mezibuněčných interakcí protein-protein a citlivou vizualizaci synapsí“ (PDF). Přírodní biotechnologie. 34 (7): 774–80. doi:10,1038 / nbt.3563. PMC  4942342. PMID  27240195.
  9. ^ Tchekanda E, Sivanesan D, Michnick SW (červen 2014). "Infračervený reportér pro detekci časoprostorové dynamiky interakcí protein-protein". Přírodní metody. 11 (6): 641–4. doi:10.1038 / nmeth.2934. PMID  24747815.
  10. ^ Rossi F, Charlton CA, Blau HM (srpen 1997). „Monitorování interakcí protein-protein v intaktních eukaryotických buňkách komplementací beta-galaktosidázy“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 94 (16): 8405–10. Bibcode:1997PNAS ... 94.8405R. doi:10.1073 / pnas.94.16.8405. PMC  22934. PMID  9237989.
  11. ^ Cassonnet P, Rolloy C, Neveu G, Vidalain PO, Chantier T, Pellet J, Jones L, Muller M, Demeret C, Gaud G, Vuillier F, Lotteau V, Tangy F, Favre M, Jacob Y (listopad 2011). "Benchmarking luciferázový komplementační test pro detekci proteinových komplexů". Přírodní metody. 8 (12): 990–2. doi:10.1038 / nmeth.1773. PMID  22127214.
  12. ^ Fujikawa, Y. a kol. (2014) Test rozdělení komplementu luciferázy k detekci regulovaných interakcí protein-protein v protoplastech rýže ve velkém měřítku. Rýže 7:11
  13. ^ Li YC, Rodewald LW, Hoppmann C, Wong ET, Lebreton S, Safar P, Patek M, Wang L, Wertman KF, Wahl GM (prosinec 2014). „Univerzální platforma pro analýzu nízkoafinitních a přechodných interakcí protein-protein v živých buňkách v reálném čase“. Zprávy buněk. 9 (5): 1946–58. doi:10.1016 / j.celrep.2014.10.058. PMC  4269221. PMID  25464845.
  14. ^ Neveu G, Cassonnet P, Vidalain PO, Rolloy C, Mendoza J, Jones L, Tangy F, Muller M, Demeret C, Tafforeau L, Lotteau V, Rabourdin-Combe C, Travé G, Dricot A, Hill DE, Vidal M, Favre M, Jacob Y (prosinec 2012). „Srovnávací analýza interakcí virus-hostitel s testem komplementace proteinu s vysokou propustností savců na základě luciferázy Gaussia princeps“. Metody. 58 (4): 349–59. doi:10.1016 / j.ymeth.2012.07.029. PMC  3546263. PMID  22898364.
  15. ^ Binkowski B, Eggers C, Butler B, Schwinn M, Slater M, Machleidt T, Cong M, Wood K, Fan F (květen 2016). „Monitorování intracelulárních proteinových interakcí pomocí binární technologie NanoLuc® (NanoBiTTM)“ (PDF). Promega.
  16. ^ Kolkhof P, Werthebach M, van de Venn A, Poschmann G, Chen L, Welte M, Stühler K, Beller M (březen 2017). „Test komplementace fragmentu luciferázy k detekci interakcí proteinů a proteinů spojených s kapkami lipidů“. Molekulární a buněčná proteomika. 16 (3): 329–345. doi:10,1074 / mcp.M116.061499. PMC  5340998. PMID  27956707.
  17. ^ Wehr MC, Laage R, Bolz U, Fischer TM, Grünewald S, Scheek S, Bach A, Nave KA, Rossner MJ (prosinec 2006). "Monitorování regulovaných interakcí protein-protein pomocí split TEV". Přírodní metody. 3 (12): 985–93. doi:10.1038 / nmeth967. PMID  17072307.
  18. ^ Dünkler A, Müller J, Johnsson N (2012). Detekce interakcí protein-protein pomocí senzoru Split-Ubiquitin. Metody v molekulární biologii. 786. str. 115–30. doi:10.1007/978-1-61779-292-2_7. ISBN  978-1-61779-291-5. PMID  21938623.

Další čtení