RecBCD - RecBCD

Exodeoxyribonukleáza V
RecBCD 1W36.png
Obrázek 1 Krystalografická struktura enzymu RecBCD (PDB: 1W36​).[1] RecB, RecC a RecD podjednotky enzymu jsou zabarveny do azurové, zelené a purpurové, zatímco částečně odvinutá šroubovice DNA, na kterou je enzym vázán, je zbarvena do hnědé.
Identifikátory
EC číslo3.1.11.5
Číslo CAS37350-26-8
Databáze
IntEnzIntEnz pohled
BRENDAVstup BRENDA
EXPASYPohled NiceZyme
KEGGVstup KEGG
MetaCycmetabolická cesta
PRIAMprofil
PDB strukturRCSB PDB PDBe PDBsum

RecBCD (ES 3.1.11.5, Exonukleáza V, Exonukleáza Escherichia coli V, Exonukleáza E. coli V, gen recBC endoenzym, RecBC deoxyribonukleáza, gen recBC DNáza, genové recBCD enzymy) je enzym z E-coli bakterie, která iniciuje rekombinační oprava potenciálně smrtící dvouvláknové zlomy v DNA které mohou být výsledkem ionizující radiace chyby replikace, endonukleázy, oxidační poškození a řada dalších faktorů.[2][3] Enzym RecBCD je jak helikáza který odvíjí nebo odděluje řetězce DNA a nukleáza který vytváří jednořetězcové zářezy v DNA.[1]

Struktura

Enzymový komplex se skládá ze tří různých podjednotek zvaných RecB, RecC a RecD, a proto má komplex název RecBCD (obrázek 1). Před objevením recD gen,[4] enzym byl znám jako „RecBC“. Každá podjednotka je kódována samostatným genem:

genřetězproteinfunkce
RecBbetaP083943'-5 'helikáza, nukleáza
RecCgamaP07648Uznává Chi (CRossover hotspot instigator)
RecDalfaP049935'-3 'helikáza

Funkce

Hlavní článek: Homologní rekombinace: cesta RecBCD
Obrázek 2 RecBCD cesta homologní rekombinace, kde je ATP v přebytku.

Obě podjednotky RecD a RecB jsou helikázy, tj., energeticky závislé molekulární motory, které odvíjejí DNA (nebo RNA v případě jiných proteinů). RecB podjednotka má navíc funkci nukleázy.[5] Nakonec enzym RecBCD (možná podjednotka RecC) rozpoznává specifickou sekvenci v DNA, 5' -GCTGGTGG-3', známý jako Chi (někdy označeno řeckým písmenem χ).

RecBCD je mezi helikázami neobvyklý, protože má dvě helikázy, které cestují různými rychlostmi[6] a protože to může rozpoznat a být pozměněno sekvencí Chi DNA.[7][8] RecBCD vášnivě váže konec lineární dvouvláknové (ds) DNA. RecD helikáza cestuje po vlákně s 5 'koncem, na kterém enzym iniciuje odvíjení, a RecB po vlákně s 3' koncem. RecB je pomalejší než RecD, takže se jednovláknová (ss) DNA smyčka hromadí před RecB (obrázek 2). To produkuje struktury DNA se dvěma ocasy ss (kratší ocas 3 'a delší ocas 5') a jednou ss smyčkou (na 3 'konci) pozorovanou elektronovou mikroskopií.[9] SS ocasy mohou žíhat, aby vytvořily druhou ss smyčku komplementární k první; takové struktury se dvěma smyčkami byly původně označovány jako „králičí uši“.

Mechanismus účinku

Obrázek 3 Začátek cesty RecBCD homologní rekombinace, kde Mg2+ je v přebytku.

Během odvíjení může nukleáza v RecB působit různými způsoby v závislosti na reakčních podmínkách, zejména na poměru koncentrací Mg2+ ionty a ATP. (1) Pokud je ATP v přebytku, enzym jednoduše napíchne vlákno s Chi (vlákno s počátečním 3 'koncem) (obrázek 2).[10][11] Odvíjení pokračuje a vytváří ocas 3 s Chi blízko jeho konce. Tento ocas může být vázán proteinem RecA, který podporuje výměnu řetězců s intaktním homologním duplexem DNA.[12] Když RecBCD dosáhne konce DNA, všechny tři podjednotky se rozloží a enzym zůstane neaktivní hodinu nebo déle;[13] molekula RecBCD, která působila na Chi, neútočí na jinou molekulu DNA. (2) Pokud Mg2+ ionty jsou v přebytku, RecBCD štěpí oba řetězce DNA endonukleolyticky, ačkoli 5 'ocas je štěpen méně často (obrázek 3).[14] Když RecBCD narazí na místo Chi na 3 'zakončeném řetězci, odvíjecí pauzy a trávení 3' ocasu se sníží.[15] Když RecBCD obnoví odvíjení, nyní štěpí opačné vlákno (tj., 5 'ocas)[16][17] a načte protein RecA na 3'-zakončené vlákno.[12] Po dokončení reakce na jedné molekule DNA enzym rychle zaútočí na druhou DNA, na které dochází ke stejným reakcím jako na první DNA.

Ačkoli ani jedna reakce nebyla ověřena analýzou intracelulární DNA, vzhledem k přechodné povaze reakčních meziproduktů, genetické důkazy naznačují, že první reakce téměř napodobuje reakci v buňkách.[2] Například aktivita Chi je ovlivněna nukleotidy na jeho 3 'stranu, a to jak v buňkách, tak při reakcích s přebytkem ATP, ale ne s Mg2+ v přebytku [PMID 27401752, 27330137]. Mutanti RecBCD postrádající detekovatelnou aktivitu exonukleázy si zachovávají vysokou aktivitu hotspotu Chi v buňkách a škrábání na Chi mimo buňky.[18] Místo Chi na jedné molekule DNA v buňkách snižuje nebo eliminuje aktivitu Chi na jiné DNA, což pravděpodobně odráží Chi-závislou demontáž RecBCD pozorovanou in vitro za podmínek přebytku ATP a škrábání DNA na Chi.[19][20]

Za obou reakčních podmínek zůstává 3 'řetězec neporušený po proudu od Chi. The RecA protein je poté aktivně naložen na 3 'ocas pomocí RecBCD.[12] V určitém neurčeném bodě se RecBCD disociuje z DNA, i když RecBCD může odvíjet alespoň 60 kb DNA, aniž by spadl. RecA iniciuje výměnu řetězce DNA, ke kterému je vázán, se stejným nebo téměř identickým řetězcem v neporušeném duplexu DNA; tato výměna řetězců generuje společnou molekulu DNA, jako je D-smyčka (obrázek 2). Předpokládá se, že společná molekula DNA je vyřešena buď replikací aktivovanou invazivním 3 'zakončeným vláknem obsahujícím Chi, nebo štěpením D-smyčky a tvorbou Hollidayova spojení. The Křižovatka Holliday může být rozdělen na lineární DNA pomocí RuvABC komplex nebo disociovaný RecG protein. Každá z těchto událostí může generovat intaktní DNA s novými kombinacemi genetických markerů, kterými se mohou rodičovské DNA lišit. Tento proces, homologní rekombinace dokončí opravu dvouvláknového zlomu DNA.

Aplikace

RecBCD je modelový enzym pro použití fluorescence jedné molekuly jako experimentální technika používaná k lepšímu pochopení funkce interakcí protein-DNA.[21] Enzym je také užitečný při odstraňování lineární DNA, jedno nebo dvouvláknové, z příprav kruhové dvouvláknové DNA, protože pro svoji aktivitu vyžaduje konec DNA.

Reference

  1. ^ A b Singleton MR, Dillingham MS, Gaudier M, Kowalczykowski SC, Wigley DB (listopad 2004). „Krystalová struktura enzymu RecBCD odhaluje stroj na zpracování zlomů DNA“. Příroda. 432 (7014): 187–93. Bibcode:2004 Natur.432..187S. doi:10.1038 / nature02988. PMID  15538360.
  2. ^ A b Smith, GR (červen 2012). „Jak enzym RecBCD a Chi podporují opravu a rekombinaci rozbití DNA: pohled molekulárního biologa“. Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2): 217–28. doi:10.1128 / MMBR.05026-11. PMC  3372252. PMID  22688812.
  3. ^ Spies M, Kowalczykowski SC (2003). "Homologní rekombinace pomocí cest RecBCD a RecF". V Higgins P (ed.). Bakteriální chromozomy. Washington, DC: ASM Press. 389–403. ISBN  1-55581-232-5.
  4. ^ Amundsen SK, Taylor AF, Chaudhury AM, Smith GR (srpen 1986). "recD: gen pro nezbytnou třetí podjednotku exonukleázy V. " Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (15): 5558–62. Bibcode:1986PNAS ... 83.5558A. doi:10.1073 / pnas.83.15.5558. PMC  386327. PMID  3526335.
  5. ^ Yu M, Souaya J, Julin DA (únor 1998). „30-kDa C-koncová doména proteinu RecB je kritická pro aktivitu nukleázy, nikoli však aktivitu helikázy, enzymu RecBCD z Escherichia coli". Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (3): 981–6. doi:10.1073 / pnas.95.3.981. PMC  18645. PMID  9448271.
  6. ^ Taylor AF, Smith GR (červen 2003). „Enzym RecBCD je DNA helikáza s rychlými a pomalými motory opačné polarity“. Příroda. 423 (6942): 889–93. Bibcode:2003 Natur.423..889T. doi:10.1038 / nature01674. PMID  12815437.
  7. ^ Taylor AF, Smith GR (červen 1992). „Enzym RecBCD se mění při štěpení DNA v hotspotu Chi rekombinace“. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (12): 5226–30. Bibcode:1992PNAS ... 89.5226T. doi:10.1073 / pnas.89.12.5226. PMC  49264. PMID  1535156.
  8. ^ Amundsen SK, Taylor AF, Reddy M, Smith GR (prosinec 2007). „Mezipodjednotková signalizace v enzymu RecBCD, komplexním proteinovém stroji regulovaném horkými místy Chi“. Genes Dev. 21 (24): 3296–307. doi:10.1101 / gad.1605807. PMC  2113030. PMID  18079176.
  9. ^ Taylor A, Smith GR (listopad 1980). "Odvíjení a převíjení DNA pomocí enzymu RecBC". Buňka. 22 (2 Pt 2): 447–57. doi:10.1016/0092-8674(80)90355-4. PMID  6256081.
  10. ^ Ponticelli, A. S .; Schultz, D. W .; Taylor, A. F .; Smith, G. R. (květen 1985). "Chi-dependentní štěpení řetězce DNA enzymem RecBC". Buňka. 41 (1): 145–151. doi:10.1016/0092-8674(85)90069-8. PMID  3888404.
  11. ^ Taylor AF, Schultz DW, Ponticelli AS, Smith GR (květen 1985). „RecBC enzymový nicking na místech Chi během odvíjení DNA: umístění a orientace závislosti řezu“. Buňka. 41 (1): 153–63. doi:10.1016/0092-8674(85)90070-4. PMID  3888405.
  12. ^ A b C Anderson DG, Kowalczykowski SC (červenec 1997). „Translokační enzym RecBCD stimuluje rekombinaci nasměrováním proteinu RecA na ssDNA způsobem regulovaným chi“. Buňka. 90 (1): 77–86. doi:10.1016 / S0092-8674 (00) 80315-3. PMID  9230304.
  13. ^ Taylor AF, Smith GR (duben 1999). „Regulace homologní rekombinace: Chi deaktivuje enzym RecBCD rozložením tří podjednotek“. Genes Dev. 13 (7): 890–900. doi:10,1101 / gad.13.7.890. PMC  316601. PMID  10197988.
  14. ^ Dixon DA, Kowalczykowski SC (duben 1993). „Rekombinační hotspot Chi je regulační sekvence, která působí zeslabením aktivity nukleáz E-coli Enzym RecBCD ". Buňka. 73 (1): 87–96. doi:10.1016 / 0092-8674 (93) 90162-J. PMID  8384931.
  15. ^ Spies M, Amitani I, Baskin RJ, Kowalczykowski SC (listopad 2007). „Enzym RecBCD přepíná podjednotky motorových motorů v reakci na rozpoznávání Chi“. Buňka. 131 (4): 694–705. doi:10.1016 / j.cell.2007.09.023. PMC  2151923. PMID  18022364.
  16. ^ Taylor AF, Smith GR (říjen 1995). "Pramenová specificita prořezávání DNA na místech Chi enzymem RecBCD. Modulace hladinami ATP a hořčíku". J Biol Chem. 270 (41): 24459–67. doi:10.1074 / jbc.270.41.24459. PMID  7592661.
  17. ^ Anderson DG, Kowalczykowski SC (březen 1997). „Rekombinace hot spot chi je regulačním prvkem, který mění polaritu degradace DNA enzymem RecBCD“. Genes Dev. 11 (5): 571–81. doi:10,1101 / gad.11.5.571. PMID  9119222.
  18. ^ Amundsen SK, Smith GR (leden 2007). "Aktivita Chi hotspotu v systému Windows Escherichia coli bez aktivity exonukleázy RecBCD: důsledky pro mechanismus rekombinace ". Genetika. 175 (1): 41–54. doi:10.1534 / genetika.106.065524. PMC  1774988. PMID  17110484.
  19. ^ Köppen A, Krobitsch S, Thoms B, Wackernagel W (červenec 1995). "Interakce s rekombinačním horkým bodem Chi in vivo převádí enzym RecBCD z Escherichia coli inaktivací podjednotky RecD na rekombinázu nezávislou na Chi ". Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14): 6249–53. Bibcode:1995PNAS ... 92,6249K. doi:10.1073 / pnas.92.14.6249. PMC  41495. PMID  7541534.
  20. ^ Myers RS, Kuzminov A, Stahl FW (červenec 1995). „Hotové místo rekombinace Chi aktivuje RecBCD rekombinaci převodem Escherichia coli na mutantní fenokopii recD ". Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14): 6244–8. Bibcode:1995PNAS ... 92,6244M. doi:10.1073 / pnas.92.14.6244. PMC  41494. PMID  7603978.
  21. ^ Bianco PR, Brewer LR, Corzett M, Balhorn R, Yeh Y, Kowalczykowski SC, Baskin RJ (leden 2001). "Procesní translokace a odvíjení DNA jednotlivými molekulami enzymu RecBCD". Příroda. 409 (6818): 374–8. Bibcode:2001 Natur.409..374B. doi:10.1038/35053131. PMID  11201750.

externí odkazy