N-acylfosfatidylethanolamin specifická fosfolipáza D - N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-acylfosfatidylethanolamin fosfolipáza D
Identifikátory
SymbolNAPEPLD
Gen NCBI222236
HGNC21683
OMIM612334
PDB4QN9
RefSeqNM_001122838
UniProtQ6IQ20
Další údaje
EC číslo3.1.4.54
MístoChr. 7 q22.1

N-acylfosfatidylethanolamin fosfolipáza D (NAPE-PLD) je enzym který katalyzuje uvolňování N-acylethanolamin (NAE) z N-acylfosfatidylethanolamin (ŠÍJE). Toto je hlavní část procesu, který převádí běžné lipidy do chemických signálů jako anandamid a oleoylethanolamin. U lidí je protein NAPE-PLD kódován NAPEPLD gen.[1][2][3][4]

Objev

NAPE-PLD je enzym aktivita - a fosfolipáza jednající dne fosfolipidy nalezen v buněčná membrána. Není homologie ale chemický výsledek jeho činnosti, který jej klasifikuje jako fosfolipáza D. Enzymatická aktivita byla objevena a charakterizována řadou experimentů, které vyvrcholily zveřejněním biochemického schématu čištění z roku 2004, z něhož peptidové sekvenování mohlo být dosaženo.[2] Výzkumní pracovníci homogenizován (jemně mletá) srdce od 150 krys a podrobili se výslednému surový lyzát na sedimentace sacharózy při 105 000 x g k oddělení buněčných membrán od zbytku buňky. The integrální membránové proteiny byly tehdy solubilizovaný použitím oktyl glukosid a podroben čtyřem sloupcová chromatografie kroky (HiTrap SP HP kationtoměničová kolona, ​​HiTrap Q aniontoměničová kolona, ​​HiTrap Blue afinitní kolona, ​​Bio-Gel HTP hydroxyapatitová kolona). Každý z nich odděluje různé typy membránových proteinů do různých nádob na vzorky, pokud jsou proteiny vymýt z kolony v průběhu času a měřením aktivity vzorků v každé nádobě bylo možné sledovat, které z nich dostaly aktivní enzym. Měření aktivity enzymu bylo provedeno tenkovrstvá chromatografie radioaktivní látky Podklad citlivé na enzymatickou aktivitu NAPE-PLD: Štěpení ovlivněného substrátu tam, kde se objevilo na destičce, když bylo záření detekováno v bioimagingovém analyzátoru.

Výsledkem tohoto rozsáhlého postupu stále nebyl čistý protein, ale produkoval omezený počet pásem SDS-PAGE a jedno pásmo 46 kilodaltonů Bylo zjištěno, že koreluje v intenzitě s enzymatickou aktivitou. Tento pás byl vyříznut z gelu a natráven trypsin a peptidy z ní byly odděleny jeden od druhého vysoce účinná kapalinová chromatografie s reverzní fází. Výsledné fragmenty byly poté mikrosekvenovány automatizací Edmanova degradace.[5] Tři odpovídaly vimentin, an střední vlákno protein 56 kDa, o kterém se předpokládá, že je kontaminantem, a další dva odpovídaly cDNA klonu, který byl následně identifikován jako NAPE-PLD.

Jakmile byla tato stopa získána, mohla být identifikace potvrzena méně náročným postupem: Nadměrná exprese domnělé cDNA NAPE-PLD v Buňky COS-7 poskytla silnou NAPE-PLD enzymatickou aktivitu, jejíž vlastnosti se ukázaly být podobné jako u původního extraktu srdce.[2]

Vlastnosti

The NAPEPLD cDNA sekvence předpovídá 396 aminokyselina sekvence u myší i potkanů, které jsou 89% a 90% identické se sekvencemi u lidí.[2] Bylo zjištěno, že NAPE-PLD nemá žádnou známou homologii fosfolipáza D geny, ale lze je klasifikovat podle homologie, aby spadly do zinku metalohydroláza rodina beta-laktamázový záhyb. Zejména vysoce konzervativní motiv H X(E /H )XD (C /R /S /H )X50–70H X15–30(C /S /D )X30–70H bylo pozorováno, což je obecně spojeno s zinek vazba a hydrolýza reakce v této třídě proteinů, což vede autory k návrhu, že aktivita by měla být korelována s obsahem zinku.

Když rekombinantní NAPE-PLD byl testován v COS buňkách in vitro měla podobnou aktivitu vůči několika radioaktivně značené substráty: N-palmitoylfosfatidylethanolamin, N-arachidonoylfosfatidylethanolamin, N-oleoylfosfatidylethanolamin a N-stearoylfosfatidylethanolamin všechny reagovaly s K.m mezi 2–4 mikromolární a a PROTImax mezi 73 a 101 nanomol za miligram za minutu podle výpočtu Lineweaver – Burkův graf.[2] (Ty generují N-palmitoylethanolamin, anandamid, N-oleoylethanolamin, a N-stearoylethanolamin, v uvedeném pořadí) Enzym také reagoval N-palmitoyl-lyso-fosfatidylethanolamin a N-arachidonoyl-lyso-fosfatidylethanolamin s podobnými Km ale na jedné třetině až jedné čtvrtině Vmax. Tyto činnosti jsou v souladu s pozorováním, že mnoho tkání produkuje řadu N-acetylethanolaminy.

NAPE-PLD však neměl schopnost produkovat detekovatelné kyselina fosfatidová z fosfatidylcholin nebo fosfatidylethanolamin jak je katalyzováno jinými fosfolipáza D enzymy. Také mu chybí transfosfatidylační aktivita fosfolipázy D, která umožňuje tvorbu fosfatidylalkoholů spíše než kyseliny fosfatidové v přítomnosti ethanol nebo butanol.

Cesta

Tento enzym funguje jako druhý krok biochemické dráhy iniciované vytvořením N-acylfosfatidylethanolamin, přenosem acylové skupiny z sn-1 pozice glycerofosfolipid na aminoskupinu fosfatidylethanolamin.[2] Zatímco NAPE-PLD přispívá k biosyntéze několika NAE u savců centrální nervový systém, není jasné, zda tento enzym není zodpovědný za tvorbu endokanabinoid anandamid, protože NAPE-PLD knockout myši byly hlášeny hladiny divokého typu nebo velmi snížené hladiny anandamidu.[6]

The N-acylethanolaminy uvolněné tímto enzymem se stávají potenciálními substráty pro amid mastné kyseliny hydroláza (FAAH), který hydrolyzuje volný mastné kyseliny z ethanolamin. Vady tohoto enzymu mohou způsobit, že se produkty NAPE-PLD, jako je anandamid, hromadí až na 15krát vyšší hladiny, než je obvykle pozorováno.[7]

Struktura

Tento membránový enzym se tvoří homodimery, částečně oddělené interním kanálem širokým ∼9-Å.[8] Metallo beta-laktamáza proteinový záhyb je uzpůsoben pro asociaci s membránou fosfolipidy. Hydrofobní dutina poskytuje vstupní cestu pro substrát ŠÍJE do aktivního místa, kde binukleární centrum zinku katalyzuje svou hydrolýzu. Žlučové kyseliny váže se s vysokou afinitou na selektivní kapsy v této dutině, což zvyšuje sestavení dimeru a umožňuje katalýzu. NAPE-PLD usnadňuje přeslechy mezi nimi žlučová kyselina a lipidové amidové signály.[8][9][10]

Reference

  1. ^ Vidět „Entrez Gene“. pro hloubkové pokrytí.
  2. ^ A b C d E F Okamoto Y, Morishita J, Tsuboi K, Tonai T, Ueda N (únor 2004). „Molekulární charakterizace anandamidu generujícího fosfolipázu D a jeho kongenerů“. The Journal of Biological Chemistry. 279 (7): 5298–305. doi:10,1074 / jbc.M306642200. PMID  14634025.
  3. ^ Curtiss NP, Bonifas JM, Lauchle JO, Balkman JD, Kratz CP, Emerling BM, Green ED, Le Beau MM, Shannon KM (květen 2005). „Izolace a analýza kandidátních myeloidních tumor supresorových genů z běžně deletovaného segmentu 7q22“. Genomika. 85 (5): 600–7. doi:10.1016 / j.ygeno.2005.01.013. PMID  15820312.
  4. ^ Egertová M, Simon GM, Cravatt BF, Elphick MR (únor 2008). „Lokalizace exprese N-acylfosfatidylethanolaminfosfolipázy D (NAPE-PLD) v myším mozku: Nový pohled na N-acylethanolaminy jako nervové signální molekuly“. The Journal of Comparative Neurology. 506 (4): 604–15. doi:10,1002 / cne.21568. PMID  18067139. S2CID  7770463.
  5. ^ „Sekvenování aminokyselin“. W.M. Keck Facility v Yale. 2006-10-23. Citováno 2009-01-12. Procise 494 cLC je popsán z pohledu koncového uživatele
  6. ^ Tsuboi K, Okamoto Y, Ikematsu N, Inoue M, Shimizu Y, Uyama T, Wang J, Deutsch DG, Burns MP, Ulloa NM, Tokumura A, Ueda N (říjen 2011). „Enzymatická tvorba N-acylethanolaminů z N-acylethanolaminového plazmatu prostřednictvím N-acylfosfatidylethanolamin hydrolyzujících fosfolipázových D-nezávislých a nezávislých drah“. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - molekulární a buněčná biologie lipidů. 1811 (10): 565–77. doi:10.1016 / j.bbalip.2011.07.009. PMID  21801852.
  7. ^ Cravatt BF, Demarest K, Patricelli MP, Bracey MH, Giang DK, Martin BR, Lichtman AH (červenec 2001). „Přecitlivělost na anandamid a zvýšená endogenní kanabinoidní signalizace u myší bez hydroxidu amidu mastné kyseliny“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 98 (16): 9371–6. doi:10.1073 / pnas.161191698. PMC  55427. PMID  11470906.
  8. ^ A b Magotti P, Bauer I, Igarashi M, Babagoli M, Marotta R, Piomelli D, Garau G (prosinec 2014). „Struktura lidské N-acylfosfatidylethanolamin-hydrolyzující fosfolipázy D: Regulace biosyntézy etanolamidu mastných kyselin žlučovými kyselinami“. Struktura. 23 (3): 598–604. doi:10.1016 / j.str.2014.12.018. PMC  4351732. PMID  25684574.
  9. ^ Kostic M (2015). „Žlučové kyseliny jako regulátory enzymů“. Chemie a biologie. 22 (4): 427–428. doi:10.1016 / j.chembiol.2015.04.007.
  10. ^ Margheritis E, Castellani B, Magotti P, Peruzzi S, Romeo E, Natali F, Mostarda S, Gioiello A, Piomelli D, Garau G (říjen 2016). „Rozpoznávání kyselin žlučových podle NAPE-PLD“. ACS Chem Biol. 11 (10): 2908–2914. doi:10.1021 / acschembio.6b00624. PMC  5074845. PMID  27571266.