Diferenciální centrifugace - Differential centrifugation
 | tento článek potřebuje další citace pro ověření. (Říjen 2009) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) |
Diferenciální centrifugace (také známý jako diferenciální rychlost centrifugace) je běžný postup v biochemie a buněčná biologie, který se používá k oddělení organely a další subcelulární částice na základě jejich rychlost sedimentace. Ačkoli se často používá v biologické analýze, je diferenciální centrifugace obecnou technikou vhodnou také pro hrubé čištění neživých suspendovaných částic (např. nanočástice, koloidní částice, viry ). V typickém případě, kdy se k analýze buněčných biologických jevů (např. Distribuce organel) používá diferenciální centrifugace, tkáň vzorek je první lyžoval rozbít buněčné membrány a uvolněte organely a cytosol. Potom se lyzát opakuje centrifugace, kde částice, které sedimentují dostatečně rychle při dané odstředivé síle po určitou dobu, tvoří na dně odstřeďovací trubice kompaktní „peletu“.[1]
Po každé centrifugaci se supernatant (nepeletovaný roztok) se vyjme ze zkumavky a znovu se centrifuguje při zvýšené koncentraci odstředivá síla a / nebo čas. Diferenciální centrifugace je vhodná pro surové separace na základě rychlosti sedimentace, ale jemnější zrnité čištění lze provádět na základě hustoty prostřednictvím rovnovážná hustota-gradientní centrifugace.[2] Metodou diferenciální centrifugace je tedy postupná peletizace částic z předchozího supernatantu s použitím stále vyšších odstřeďovacích sil.[3] Buněčné organely oddělené diferenciální centrifugací udržují relativně vysoký stupeň normálního fungování, pokud během izolace nepodléhají denaturačním podmínkám.[4][5]
Teorie
Ve viskózní tekutině hodnotit z sedimentace dané suspendované částice (pokud je částice hustší než kapalina) je do značné míry funkcí následujících faktorů:
- Gravitační síla
- Rozdíl v hustotě
- Viskozita kapaliny
- Velikost a tvar částic
Větší částice sedimentují rychleji a při nižších odstředivých silách. Pokud je částice méně hustá než kapalina (např. Tuky ve vodě), nebude sedimentovat, ale bude se vznášet, bez ohledu na sílu g-síly, kterou částice zažívá. Odstředivá síla odděluje složky nejen na základě hustoty, ale také velikosti a tvaru částic. Naproti tomu specializovanější rovnovážná hustota-gradientní centrifugace produkuje separační profil v závislosti na samotné hustotě částic, a proto je vhodný pro jemnozrnnější separace.
Díky vysoké g-síle je sedimentace malých částic mnohem rychlejší než Brownian difúze, dokonce i pro velmi malé (nanoměřítko) částice. Při použití odstředivky Stokesův zákon musí být upraven tak, aby zohledňoval kolísání síly g se vzdáleností od středu otáčení.[6]
kde
- D je minimální průměr částic, u nichž se očekává sedimentace (m)
- η (nebo µ) je tekutina dynamická viskozita (Pa.s)
- RF je konečný poloměr otáčení (m)
- Ri je počáteční poloměr otáčení (m)
- ρp je objemová hmotnostní hustota částic (kg / m³)
- ρF je objemová objemová hmotnost kapaliny (kg / m³)
- ω je úhlová rychlost (radián / s)
- t je čas potřebný k sedimentaci z R.i do R.F (s)
Postup
Diferenciální centrifugace může být použita s intaktními částicemi (např. Biologickými buňkami, mikročásticemi, nanočásticemi) nebo k oddělení jednotlivých částí dané částice.[7] Na příkladu separace eukaryotických organel z intaktních buněk musí být buňka nejprve lyžována a homogenizován (ideálně jemnou technikou, jako je homogenizace dounce; tvrdší techniky nebo nadměrná homogenizace povedou k nižšímu podílu intaktních organel). Jakmile je získán surový extrakt z organel, může být podroben různým rychlostem centrifugace, aby se organely oddělily:
| Ukázkový vstup | G síla | Čas | Potřebný nástroj | Obsah pelet | Obsah supernatantu |
|---|---|---|---|---|---|
| Nelyzované (eukaryotické) buňky | 100 x g | 5 minut | Stolní odstředivka s pevným úhlem nebo výkyvná lopatková odstředivka | Neporušené (eukaryotické) buňky, makroskopické zbytky | Liší se v závislosti na vzorku |
| Jemně lýzované buňky (např. Dounce homogenizer) | 600 x g | 10 min | Stolní odstředivka s pevným úhlem nebo výkyvná lopatková odstředivka | Jádra | Cytosol, nenukleové organely |
| Supernatant z předchozí řady | 15 000 x g | 20 min | Stolní odstředivka s pevným úhlem | Mitochondrie, chloroplasty, lysozomy, peroxisomy | Cytosol, mikrosomy (známý jako post mitochondriální supernatant) |
| Supernatant z předchozí řady | 50 000 x g - 100 000 x g | 60 min | Vysokorychlostní odstředivka s pevným úhlem nebo vakuová ultracentrifuga | Plazmatická membrána, mikrosomální frakce, velké polyribozomy | Cytosol, ribozomální podjednotky, malé polyribozomy, enzymové komplexy |
| Supernatant z předchozí řady | 50 000 x g - 100 000 x g | 120 min | Vakuová ultracentrifuga | Ribozomální podjednotky, malé poly ribozomy, některé rozpustné enzymové komplexy | Cytosol |
Ultracentrifugace
Lyzovaný vzorek je nyní připraven k centrifugaci v an ultracentrifuga. Ultracentrifuga se skládá z chlazené nízkotlaké komory obsahující rotor, který je poháněn elektrickým motorem schopným vysokorychlostní rotace. Vzorky jsou umístěny do zkumavek uvnitř nebo připojeny k rotoru. Rychlost otáčení může dosáhnout až 100 000 ot / min pro podlahový model, 150 000 ot / min pro stolní model (Beckman Optima Max-XP nebo Sorvall MTX150), což vytváří síly odstředivé rychlosti od 800 000 g do 1 000 000 g. Tato síla způsobuje sedimentace makromolekul a může dokonce způsobit nejednotnou distribuci malých molekul.[8]
Protože různé fragmenty buňky mají různé velikosti a hustoty, každý fragment se usadí do pelety s různými minimálními odstředivými silami. Rozdělení vzorku do různých vrstev lze tedy provést nejprve odstředěním původního lyzátu za slabých sil, odstraněním pelety a následným vystavením následných supernatantů postupně větším odstředivým polím. Pokaždé, když se část různé hustoty usadí na dno nádoby a extrahuje se, a opakovaná aplikace vytváří řadu vrstev, které zahrnují různé části původního vzorku. Lze podniknout další kroky k dalšímu zušlechťování každé ze získaných pelet.
Sedimentace závisí na hmotnosti, tvaru a částečný specifický objem makromolekuly, stejně jako hustota rozpouštědla, velikost rotoru a rychlost otáčení. Rychlost sedimentace lze během výpočtu sledovat a vypočítat molekulární váha.Hodnoty sedimentační koeficient (S) lze vypočítat. Velké hodnoty S (rychlejší rychlost sedimentace) odpovídají větší molekulové hmotnosti. Husté částicové sedimenty rychleji. Podlouhlé proteiny mají větší třecí koeficienty a pro zajištění přesnosti sedimentují pomaleji.[9]
Rozdíly mezi diferenciální a hustotní gradientovou centrifugací
Rozdíl mezi technikami centrifugace s diferenciálním a hustotním gradientem spočívá v tom, že druhá metoda používá roztoky různých hustot (např. Sacharózy, ficolu) nebo gelů, kterými vzorek prochází. To odděluje vzorek do vrstev relativní hustotou, na základě principu, že molekuly se usazují pod odstředivou silou, dokud nedosáhnou média s hustotou stejnou jako oni.[10] Stupeň oddělení nebo počet vrstev závisí na roztoku nebo gelu. Diferenciální centrifugace na druhé straně nevyužívá gradient hustoty a centrifugace se provádí stále rychlejšími rychlostmi. Různé rychlosti centrifugace často vytvářejí separaci do ne více než dvou frakcí, takže supernatant může být dále separován v dalších centrifugačních krocích. Za tímto účelem musí být rychlost odstředění zvyšována, dokud se požadované částice neoddělí. Naproti tomu centrifugace s hustotním gradientem se obvykle provádí pouze jednou rychlostí centrifugace.[11]
Viz také
| Prostředky knihovny o Ultracentrifugace |
Reference
- ^ Ohlendieck, Kay; Harding, Stephen E. (19. dubna 2018). "Odstředění a ultracentrifugace". Wilson a Walkerovy principy a techniky biochemie a molekulární biologie: 424–453. doi:10.1017/9781316677056.014. ISBN 9781107162273.
- ^ A b Darnell, James; Baltimore, David; Matsudaira, Paul; Zipursky, S. Lawrence; Berk, Arnold; Lodish, Harvey (2000). „Čištění buněk a jejich částí“. Citovat deník vyžaduje
| deník =(Pomoc) - ^ Griffith, Owen Mitch (2010). Praktické techniky pro odstředivé separace - Průvodce aplikací (PDF). Principy a techniky biochemie a molekulární biologie. p. 1-27.
- ^ Gerald Karp (19. října 2009). Buněčná a molekulární biologie: koncepty a experimenty. John Wiley & Sons. str. 28–. ISBN 978-0-470-48337-4.
- ^ Livshits, Michail A .; Khomyakova, Elena; Evtushenko, Evgeniy G .; Lazarev, Vassili N .; Kulemin, Nikolay A .; Semina, Svetlana E .; Generozov, Edward V .; Govorun, Vadim M. (30. listopadu 2015). „Izolace exosomů diferenciální centrifugací: Teoretická analýza běžně používaného protokolu“. Vědecké zprávy. 5 (1): 17319. Bibcode:2015NatSR ... 517319L. doi:10.1038 / srep17319. ISSN 2045-2322. S2CID 14200669.
- ^ Harding, Stephen E .; Scott, David; Rowe, Arther (16. prosince 2007). Analytická ultracentrifugace: techniky a metody. Royal Society of Chemistry. ISBN 978-1-84755-261-7.
- ^ Frei, Marku. „Separace centrifugace“. Biosoubory. 6 (5): 6–7.
- ^ Taylor, Douglas D .; Shah, Sahil (1. října 2015). „Metody izolace extracelulárních vezikul ovlivňují následné analýzy jejich nákladu.“ Metody. 87: 3–10. doi:10.1016 / j.ymeth.2015.02.019. PMID 25766927.
- ^ Vance, Dennis E .; Vance, J. E. (6. srpna 1996). "Struktura, shromáždění a sekrece lipoproteinů". Biochemie lipidů, lipoproteinů a membrán. Elsevier. ISBN 978-0-08-086092-3.
- ^ Sapkota, Anupama (3. září 2020). „Druhy odstředivky a odstředění (definice, princip, použití)“. Poznámky k mikrobům.
- ^ Yu, Li-Li; Zhu, Jing; Liu, Jin-Xia; Jiang, Feng; Ni, Wen-Kai; Qu, Li-Shuai; Ni, Run-Zhou; Lu, Cui-Hua; Xiao, Ming-Bing (2018). „Srovnání tradičních a nových metod pro oddělení exozomů od lidských vzorků“. BioMed Research International. 2018: 1–9. doi:10.1155/2018/3634563. PMC 6083592. PMID 30148165.
