Reverzní transkriptáza - Reverse transcriptase

Reverzní transkriptáza
(RNA-dependentní DNA polymeráza)
Reverse transcriptase 3KLF labels.png
Krystalografická struktura HIV -1 reverzní transkriptáza, kde jsou dvě podjednotky p51 a p66 zbarveny a jsou zvýrazněna aktivní místa polymerázy a nukleázy.[1]
Identifikátory
SymbolRVT_1
PfamPF00078
Pfam klanCL0027
InterProIPR000477
STRÁNKAPS50878
SCOP21 hmv / Rozsah / SUPFAM
CDDcd00304
RNA-řízená DNA polymeráza
Identifikátory
EC číslo2.7.7.49
Číslo CAS9068-38-6
Databáze
IntEnzIntEnz pohled
BRENDAVstup BRENDA
EXPASYPohled NiceZyme
KEGGVstup KEGG
MetaCycmetabolická cesta
PRIAMprofil
PDB strukturRCSB PDB PDBe PDBsum
Genová ontologieAmiGO / QuickGO

A reverzní transkriptáza (RT) je enzym slouží ke generování komplementární DNA (cDNA) z RNA šablona, ​​proces nazývaný reverzní transkripce. Reverzní transkriptázy jsou používány určitými viry jako HIV a virus hepatitidy B. replikovat jejich genomy retrotransposon mobilní genetické prvky k proliferaci v hostitelském genomu a eukaryotický buňky k rozšíření telomery na konci jejich lineární chromozomy. Navzdory široce rozšířené víře tento proces neporušuje toky genetické informace popsané klasikou centrální dogma, protože přenosy informací z RNA do DNA jsou výslovně považovány za možné.[2][3][4]

Retrovirová RT má tři po sobě následující biochemické aktivity: závislé na RNA DNA polymeráza aktivita, ribonukleáza H (RNáza H) a aktivita DNA polymerázy závislá na DNA. Společně tyto aktivity umožňují enzymu převádět jednovláknovou RNA na dvouvláknovou cDNA. U retrovirů a retrotranspozonů se tato cDNA může integrovat do hostitelského genomu, ze kterého lze prostřednictvím hostitelské buňky vytvářet nové kopie RNA. transkripce. Stejná sekvence reakcí je široce používána v laboratoři pro převod RNA na DNA pro použití v molekulární klonování, Sekvenování RNA, polymerázová řetězová reakce (PCR) nebo analýza genomu.

Dějiny

Reverzní transkriptázy byly objeveny Howard Temin na University of Wisconsin – Madison v Rousův sarkom viriony[5] a nezávisle izolován David Baltimore v roce 1970 v MIT ze dvou RNA nádorových virů: virus myší leukémie a znovu Virus Rousova sarkomu.[6] Za své úspěchy sdíleli rok 1975 Nobelova cena za fyziologii nebo medicínu (s Renato Dulbecco ).

Dobře prostudované reverzní transkriptázy zahrnují:

Funkce u virů

Reverzní transkriptáza je zobrazena svými oblastmi prstů, dlaní a palců. Katalytický aminokyseliny z RNáza H aktivní stránky a polymeráza aktivní stránky jsou zobrazeny ve formě koule a tyčinky.

Enzymy jsou kódovány a používány viry, které používají reverzní transkripci jako krok v procesu replikace. Reverzní přepis RNA viry, jako retroviry, použijte enzym k reverzní transkripci jejich RNA genomy do DNA, která je poté integrována do hostitelského genomu a replikována spolu s ním. Reverzní přepis DNA viry, tak jako hepadnaviry, může umožnit RNA sloužit jako templát při sestavování a výrobě řetězců DNA. HIV infikuje člověka použitím tohoto enzymu. Bez reverzní transkriptázy by virový genom nebyl schopen začlenit se do hostitelské buňky, což by vedlo k selhání replikace.

Proces reverzní transkripce nebo retrotranskripce

Reverzní transkriptáza vytváří dvouvláknovou DNA z templátu RNA.

U virových druhů s reverzní transkriptázou, která postrádá aktivitu DNA-polymerázy závislou na DNA, lze tvorbu dvouřetězcové DNA provést hostitelem DNA polymeráza δ zaměňovat virovou DNA-RNA s primerem a syntetizovat dvouvláknovou DNA podobným mechanismem jako v odstranění primeru, kde nově syntetizovaná DNA vytěsňuje původní templát RNA.

Proces reverzní transkripce, nazývaný také retrotranskripce nebo retrotras, je extrémně náchylný k chybám a právě během tohoto kroku může dojít k mutacím. Takové mutace mohou způsobit odolnost vůči lékům.

Retrovirová reverzní transkripce

Mechanismus reverzní transkripce u HIV. Čísla kroků se neshodují.

Retroviry, označované také jako třída VI ssRNA-RT viry, jsou RNA reverzně transkribující viry s meziproduktem DNA. Jejich genomy se skládají ze dvou molekul pozitivní smysl jednořetězcová RNA s a 5 'čepice a 3 'polyadenylovaný ocas. Mezi příklady retrovirů patří virus lidské imunodeficience (HIV ) a lidský T-lymfotropní virus (HTLV ). K tvorbě dvouvláknové DNA dochází v cytosol[10] jako série těchto kroků:

  1. Lysyl tRNA působí jako primer a hybridizuje s komplementární částí genomu virové RNA, která se nazývá vazebné místo pro primer nebo PBS.
  2. Reverzní transkriptáza poté syntetizuje DNA nukleotidy na 3 'konci primeru DNA komplementární na U5 (nekódující oblast) a R oblast (přímá repetice na obou koncích molekuly RNA) virové RNA.
  3. Doména na enzymu reverzní transkriptázy zvaná RNAse H degraduje oblasti U5 a R na 5 'konci RNA.
  4. Primér tRNA pak „přeskočí“ na 3 'konec virového genomu a nově syntetizované řetězce DNA hybridizují s komplementární oblastí R na RNA.
  5. Doplňková DNA (cDNA) přidaná do (2) se dále rozšiřuje.
  6. Většina virové RNA je degradována RNAsou H, přičemž zůstává pouze PP sekvence.
  7. Syntéza druhého řetězce DNA začíná za použití zbývajícího PP fragmentu virové RNA jako primeru.
  8. Primér tRNA odejde a nastane „skok“. PBS z druhého řetězce hybridizuje s doplňkovým PBS na prvním řetězci.
  9. Obě vlákna jsou prodloužena a tvoří úplnou dvouřetězcovou kopii DNA původního genomu virové RNA, která může být enzymem začleněna do genomu hostitele integráza.

Tvorba dvouvláknové DNA také zahrnuje přenos vlákna, ve kterém dochází k translokaci produktu krátké DNA z počáteční syntézy DNA závislé na RNA do oblastí akceptorových templátů na druhém konci genomu, které jsou později dosaženy a zpracovány reverzní transkriptázou na aktivitu DNA závislou na DNA.[11]

Retrovirová RNA je uspořádána na 5 'konci až 3' konci. Místo, kde primer je napojen na virovou RNA se nazývá vazebné místo pro primer (PBS). RNA 5'end na PBS se nazývá U5 a konec RNA 3 'na PBS se nazývá leader. Primér tRNA se odvíjí mezi 14 a 22 nukleotidy a tvoří bázově spárovaný duplex s virovou RNA v PBS. Skutečnost, že PBS se nachází v blízkosti 5 'konce virové RNA, je neobvyklá, protože reverzní transkriptáza syntetizuje DNA ze 3' konce primeru ve směru 5 'až 3' (s ohledem na nově syntetizovaný řetězec DNA). Proto musí být primer a reverzní transkriptáza přemístěny na 3 'konec virové RNA. Aby bylo možné dosáhnout tohoto přemístění, zahrnuje několik kroků a různé enzymy DNA polymeráza, ribonukleáza H (RNáza H) a odvíjení polynukleotidů jsou potřebné.[12][13]

HIV reverzní transkriptáza také má ribonukleáza aktivita, která degraduje virovou RNA během syntézy cDNA, stejně jako DNA-dependentní DNA polymeráza aktivita, která kopíruje smysl cDNA řetězec do antisense DNA za vzniku dvouvláknového meziproduktu virové DNA (vDNA).[14]

V buněčném životě

Samoreplikující se úseky eukaryotický genomy známé jako retrotranspozony využívat reverzní transkriptázu k přesunu z jedné pozice v genomu do druhé prostřednictvím RNA meziproduktu. Vyskytují se hojně v genomech rostlin a živočichů. Telomeráza je další reverzní transkriptáza nalezená v mnoha eukaryotech, včetně lidí, která nese svoji vlastní RNA šablona; tato RNA se používá jako šablona pro replikace DNA.[15]

První zprávy o reverzní transkriptáze u prokaryot přišly již v roce 1971 ve Francii (Beljanski et al., 1971a, 1972) ao několik let později v SSSR (Romashchenko 1977[16]). Ty byly od té doby široce popsány jako součást bakterií Retrony, odlišné sekvence, které kódují reverzní transkriptázu a jsou použity při syntéze msDNA. K zahájení syntézy DNA je nutný primer. V bakteriích je primer syntetizován během replikace.[17]

Valerian Dolja ze státu Oregon tvrdí, že viry díky své rozmanitosti hrály evoluční roli ve vývoji buněčného života, přičemž ústřední roli hrála reverzní transkriptáza.[18]

Struktura

Reverzní transkriptáza využívá strukturu "pravé ruky" podobnou struktuře nalezené v jiných virové polymerázy nukleových kyselin.[19][20] Kromě transkripční funkce mají retrovirové reverzní transkriptázy doménu patřící do RNáza H rodiny, což je pro jejich replikaci zásadní. Degradací templátu RNA umožňuje syntetizovat druhý řetězec DNA.[21] Některé fragmenty z trávení slouží také jako primer pro DNA polymeráza (buď stejný enzym, nebo hostitelský protein), odpovědný za vytvoření druhého (plus) řetězce.[19]

Věrnost replikace

Během životního cyklu retroviru existují tři různé replikační systémy. Reverzní transkriptáza nejprve syntetizuje virovou DNA z virové RNA a poté z nově vytvořeného komplementárního řetězce DNA. Druhý replikační proces nastává, když hostitelská buněčná DNA polymeráza replikuje integrovanou virovou DNA. A konečně, RNA polymeráza II přepisuje provirovou DNA na RNA, která bude zabalena do virionů. Proto může dojít k mutaci během jednoho nebo všech těchto kroků replikace.[22]

Reverzní transkriptáza má vysokou míru chyb při přepisu RNA na DNA, protože na rozdíl od většiny ostatních DNA polymerázy, nemá korektura schopnost. Tato vysoká chybovost umožňuje mutace hromadit se zrychlenou rychlostí ve srovnání s korekturami forem replikace. Komerčně dostupné reverzní transkriptázy produkované Promega jejich příručky uvádějí, že mají chybovost v rozsahu 1 ze 17 000 bází pro AMV a 1 ze 30 000 bází pro M-MLV.[23]

Kromě vytváření jedno-nukleotidové polymorfismy Bylo také prokázáno, že reverzní transkriptázy jsou zapojeny do procesů, jako je fúze přepisu, míchání exonů a vytváření umělých antisense přepisy.[24][25] Spekulovalo se, že tohle přepínání šablon aktivita reverzní transkriptázy, kterou lze zcela prokázat in vivo, může být jednou z příčin nalezení několika tisíc neoznačených přepisů v genomech modelových organismů.[26]

Přepínání šablon

Dva RNA genomy jsou zabaleny do každé částice retroviru, ale po infekci každý virus generuje pouze jednu provirus.[27] Po infekci je reverzní transkripce doprovázena přepínáním templátu mezi dvěma kopiemi genomu (rekombinace volby kopie)[27]. V každém replikačním cyklu se vyskytuje 5 až 14 rekombinačních událostí na genom.[28] Přepínání templátů (rekombinace) se jeví jako nezbytné pro zachování integrity genomu a jako opravný mechanismus pro záchranu poškozených genomů.[29][27]

Aplikace

Molekulární struktura zidovudin (AZT), lék používaný k inhibici reverzní transkriptázy

Antivirotika

Další informace: Inhibitor reverzní transkriptázy

Tak jako HIV používá reverzní transkriptázu ke kopírování svého genetického materiálu a generování nových virů (součást kruhu šíření retrovirů), byly vyvinuty specifické léky, které narušují proces a tím potlačují jeho růst. Souhrnně jsou tyto léky známé jako inhibitory reverzní transkriptázy a zahrnují nukleosidové a nukleotidové analogy zidovudin (obchodní název Retrovir), lamivudin (Epivir) a tenofovir (Viread), stejně jako nenukleosidové inhibitory, jako např nevirapin (Viramune).

Molekulární biologie

Další informace: Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce

Reverzní transkriptáza se běžně používá ve výzkumu k aplikaci polymerázová řetězová reakce technika RNA v technice zvané polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí (RT-PCR). Klasický PCR techniku ​​lze použít pouze na DNA řetězce, ale pomocí reverzní transkriptázy může být RNA transkribována do DNA, čímž dochází k tvorbě PCR možná analýza molekul RNA. Reverzní transkriptáza se používá také k vytváření cDNA knihovny z mRNA. Komerční dostupnost reverzní transkriptázy výrazně zlepšila znalosti v oblasti molekulární biologie, as, spolu s dalšími enzymy umožnilo vědcům klonovat, sekvenovat a charakterizovat RNA.

Reverzní transkriptáza byla také použita v inzulín Výroba. Vložením eukaryotické mRNA pro produkci inzulínu spolu s reverzní transkriptázou do bakterií mohla být mRNA vložena do genomu prokaryota. Poté lze vytvořit velké množství inzulínu, čímž se vyhnete potřebě sklízet prasečí slinivku a další podobné tradiční zdroje. Přímé vložení eukaryotické DNA do bakterií by nefungovalo, protože nese introny by se tedy nepodařilo úspěšně přeložit pomocí bakteriálních ribozomů. Zpracování v eukaryotické buňce během produkce mRNA odstraňuje tyto introny a poskytuje vhodný templát. Reverzní transkriptáza přeměnila tuto upravenou RNA zpět na DNA, aby mohla být začleněna do genomu.

Viz také

Reference

  1. ^ PDB: 3KLF​; Tu X, Das K, Han Q, Bauman JD, Clark AD, Hou X, Frenkel YV, Gaffney BL, Jones RA, Boyer PL, Hughes SH, Sarafianos SG, Arnold E (říjen 2010). „Strukturální základ rezistence HIV-1 na AZT excizí“. Přírodní strukturní a molekulární biologie. 17 (10): 1202–9. doi:10.1038 / nsmb.1908. PMC  2987654. PMID  20852643.
  2. ^ Crick, Francis (1970). "Centrální dogma molekulární biologie". Příroda. 227 (5258): 561–563. Bibcode:1970Natur.227..561C. doi:10.1038 / 227561a0. PMID  4913914. S2CID  4164029.
  3. ^ Sarkar, Sahotra (1996). Filozofie a dějiny molekulární biologie: Nové perspektivy. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. p. 187–232.
  4. ^ Danchin, Étienne; Pocheville, Arnaud; Rey, Olivier; Pujol, Benoît; Blanchet, Simon (2019). „Epigeneticky usnadněná mutační asimilace: epigenetika jako uzel v rámci inkluzivní evoluční syntézy“. Biologické recenze. 94: 259-282. doi:10.1111 / brv.12453. S2CID  67861162.
  5. ^ Temin HM, Mizutani S (červen 1970). "RNA-dependentní DNA polymeráza ve virionech viru Rousova sarkomu". Příroda. 226 (5252): 1211–3. doi:10.1038 / 2261211a0. PMID  4316301. S2CID  4187764.
  6. ^ Baltimore D (červen 1970). „RNA-dependentní DNA polymeráza ve virionech RNA nádorových virů“. Příroda. 226 (5252): 1209–11. doi:10.1038 / 2261209a0. PMID  4316300. S2CID  4222378.
  7. ^ Ferris AL, Hizi A, Showalter SD, Pichuantes S, Babe L, Craik CS, Hughes SH (duben 1990). "Imunologická a proteolytická analýza struktury reverzní transkriptázy HIV-1" (PDF). Virologie. 175 (2): 456–64. doi:10.1016 / 0042-6822 (90) 90430 let. PMID  1691562.
  8. ^ A b Konishi A, Yasukawa K, Inouye K (červenec 2012). „Zlepšení tepelné stability reverzní transkriptázy α-podjednotky viru ptačí myeloblastózy místně cílenou mutagenezí“ (PDF). Biotechnologické dopisy. 34 (7): 1209–15. doi:10.1007 / s10529-012-0904-9. hdl:2433/157247. PMID  22426840. S2CID  207096569.
  9. ^ Autexier, Chantal; Lue, Neal F. (červen 2006). "Struktura a funkce reverzní transkriptázy telomerázy". Roční přehled biochemie. 75 (1): 493–517. doi:10.1146 / annurev.biochem.75.103004.142412. PMID  16756500.
  10. ^ Bio-Medicine.org - retrovirus Citováno dne 17. února 2009
  11. ^ Telesnitsky A, Goff SP (1993). Msgstr "Přenos silného zastavení řetězce během reverzní transkripce". V Skalka MA, Goff SP (eds.). Reverzní transkriptáza (1. vyd.). New York: Cold Spring Harbor. p. 49. ISBN  978-0-87969-382-4.
  12. ^ Bernstein A, Weiss R, Tooze J (1985). "RNA nádorové viry". Molekulární biologie nádorových virů (2. vyd.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
  13. ^ Moelling K, Broecker F (duben 2015). "Reverzní transkriptáza-RNáza H: od virů k antivirové obraně". Annals of the New York Academy of Sciences. 1341 (1): 126–35. Bibcode:2015NYASA1341..126M. doi:10.1111 / nyas.12668. PMID  25703292. S2CID  42378727.
  14. ^ Kaiser GE (leden 2008). „Životní cyklus HIV“. Domovská stránka mikrobiologie Doc Kaisera. Community College of Baltimore Count. Archivovány od originál dne 26. 7. 2010.
  15. ^ Krieger M, Scott MP, Matsudaira PT, Lodish HF, Darnell JE, Zipursky L, Kaiser C, Berk A (2004). Molekulární buněčná biologie. New York: W.H. Freeman a CO. ISBN  978-0-7167-4366-8.
  16. ^ Romashchenko, A.G .; et al. (1977). „Otdelenie ot preparatov DNK-polimeraz I RNK-zavisimoy DNK-polimeraz; oshistka i svoystva fermenta". Sborník Akademie věd SSSR. 233: 734–737.
  17. ^ Hurwitz J, Leis JP (leden 1972). „RNA-dependentní DNA polymerázová aktivita RNA nádorových virů. I. Přímý vliv DNA v reakci“. Journal of Virology. 9 (1): 116–29. doi:10.1128 / JVI.9.1.116-129.1972. PMC  356270. PMID  4333538.
  18. ^ Arnold C (17. července 2014). „Mohly by obří viry být původem života na Zemi?“. národní geografie. Citováno 29. května 2016.
  19. ^ A b Sarafianos SG, Marchand B, Das K, Himmel DM, Parniak MA, Hughes SH, Arnold E (leden 2009). "Struktura a funkce reverzní transkriptázy HIV-1: molekulární mechanismy polymerace a inhibice". Journal of Molecular Biology. 385 (3): 693–713. doi:10.1016 / j.jmb.2008.10.071. PMC  2881421. PMID  19022262.
  20. ^ Hansen JL, Long AM, Schultz SC (srpen 1997). "Struktura RNA-dependentní RNA polymerázy polioviru". Struktura. 5 (8): 1109–22. doi:10.1016 / S0969-2126 (97) 00261-X. PMID  9309225.
  21. ^ Schultz SJ, Champoux JJ (červen 2008). „Aktivita RNázy H: struktura, specificita a funkce v reverzní transkripci“. Virový výzkum. 134 (1–2): 86–103. doi:10.1016 / j.virusres.2007.12.007. PMC  2464458. PMID  18261820.
  22. ^ Bbenek K, Kunkel AT (1993). "Věrnost retrovirových reverzních transkriptáz". V Skalka MA, Goff PS (eds.). Reverzní transkriptáza. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. p. 85. ISBN  978-0-87969-382-4.
  23. ^ "Návod k použití sady Promega" (PDF). 1999. Archivovány od originál (PDF) dne 21. 11. 2006.
  24. ^ Houseley J, Tollervey D (srpen 2010). „Zdánlivý nekanonický trans-sestřih je generován reverzní transkriptázou in vitro“. PLOS ONE. 5 (8): e12271. Bibcode:2010PLoSO ... 512271H. doi:10.1371 / journal.pone.0012271. PMC  2923612. PMID  20805885.
  25. ^ Zeng XC, Wang SX (červen 2002). „Důkaz, že cDNA BmTXK beta-BmKCT od čínského štíra Buthus martensii Karsch je artefakt generovaný v procesu reverzní transkripce“. FEBS Dopisy. 520 (1–3): 183–4, odpověď autora 185. doi:10.1016 / S0014-5793 (02) 02812-0. PMID  12044895. S2CID  24619868.
  26. ^ van Bakel H, Nislow C, Blencowe BJ, Hughes TR (2011). „Odpověď na“ Realita všudypřítomného přepisu"". PLOS Biology. 9 (7): e1001102. doi:10.1371 / journal.pbio.1001102. PMC  3134445.
  27. ^ A b C Rawson JMO, Nikolaitchik OA, Keele BF, Pathak VK, Hu WS. K účinné replikaci HIV-1 a zachování integrity virového genomu je nutná rekombinace. Nucleic Acids Res. 2018 Nov 16; 46 (20): 10535-10545. doi: 10,1093 / nar / gky910. PMID: 30307534
  28. ^ Cromer D, Grimm AJ, Schlub TE, Mak J, Davenport MP. Odhad rychlosti přepínání a rekombinace HIV šablony in-vivo. AIDS. 2016 Jan; 30 (2): 185-92. Doi: 10.1097 / QAD.0000000000000936. PMID: 26691546
  29. ^ Hu WS, Temin HM. Retrovirová rekombinace a reverzní transkripce. Věda. 30. listopadu 1990; 250 (4985): 1227-33. PMID: 1700865

externí odkazy