Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce - Reverse transcription polymerase chain reaction

Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) je kombinovaná laboratorní technika reverzní transkripce z RNA do DNA (v této souvislosti tzv komplementární DNA nebo cDNA) a amplifikace specifických cílů DNA pomocí polymerázová řetězová reakce (PCR).[1] Primárně se používá k měření množství specifické RNA. Toho je dosaženo sledováním amplifikační reakce pomocí fluorescence, tzv. Techniky real-time PCR nebo kvantitativní PCR (qPCR). K analýze se běžně používá kombinovaná RT-PCR a qPCR genová exprese a kvantifikace virové RNA ve výzkumu a klinických podmínkách.
Úzká souvislost mezi RT-PCR a qPCR vedla k metonymický použití termínu qPCR ve smyslu RT-PCR. Takové použití může být matoucí,[2] protože RT-PCR lze použít bez qPCR, například pro povolení molekulární klonování, sekvenování nebo jednoduchá detekce RNA. Naopak, qPCR lze použít bez RT-PCR, například ke kvantifikaci číslo kopie konkrétního kusu DNA.
Nomenklatura
Kombinovaná technika RT-PCR a qPCR byla popsána jako kvantitativní RT-PCR[3] nebo RT-PCR v reálném čase[4] (někdy se dokonce nazývá kvantitativní RT-PCR v reálném čase[5]), byl různě zkrácen jako qRT-PCR,[6] RT-qPCR,[7] RRT-PCR,[8] a rRT-PCR.[9] Aby se předešlo nejasnostem, budou se v tomto článku důsledně používat následující zkratky:
Technika | Zkratka |
---|---|
Polymerázová řetězová reakce | PCR |
Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce | RT-PCR |
Polymerázová řetězová reakce v reálném čase | qPCR |
Kombinovaná technika RT-PCR / qPCR | qRT-PCR |
Ne všichni autoři, zejména ti starší, používají tuto konvenci a čtenář by měl být při sledování odkazů opatrný. RT-PCR byla použita k označení jak real-time PCR (qPCR), tak reverzní transkripční PCR (RT-PCR).
Dějiny
Od svého zavedení v roce 1977 Northern blot byl i přes své nedostatky značně používán pro kvantifikaci RNA: (a) časově náročná technika, (b) vyžaduje pro detekci velké množství RNA a (c) kvantitativně nepřesné v malém množství obsahu RNA.[10][11] Od svého vynálezu Karyho Mullise v roce 1983 však RT PCR od té doby vytlačila Northern blot jako metodu volby pro detekci a kvantifikaci RNA.[12]
RT-PCR se stala srovnávací technologií pro detekci a / nebo srovnání hladin RNA z několika důvodů: (a) nevyžaduje zpracování po PCR, (b) široký rozsah (> 107lze měřit hojnost RNA a (c) poskytuje vhled do kvalitativních i kvantitativních údajů.[5] Díky své jednoduchosti, specificitě a citlivosti se RT-PCR používá v široké škále aplikace z experimentů tak jednoduchých jako kvantifikace kvasinkové buňky ve víně na složitější použití jako diagnostické nástroje pro detekci infekčních agens, jako je ptačí chřipka virus a SARS-CoV-2.[13][14][15]
Zásady
V RT-PCR je RNA šablona se nejprve převede na komplementární DNA (cDNA) pomocí a reverzní transkriptáza. CDNA se poté použije jako templát pro exponenciální amplifikaci pomocí PCR. QT-NASBA je v současnosti nejcitlivější dostupnou metodou detekce RNA.[16][irelevantní citace ] Použití RT-PCR k detekci transkriptu RNA přineslo revoluci ve studiu genové exprese následujícími důležitými způsoby:
- Teoreticky bylo možné detekovat přepisy prakticky jakéhokoli genu[17]
- Povolila amplifikaci vzorku a eliminovala potřebu bohatého výchozího materiálu požadovaného při použití analýzy Northern blot[18][19]
- Poskytuje toleranci k degradaci RNA, pokud je RNA překlenující primer neporušená[18]
Jednostupňová RT-PCR vs. dvoustupňová RT-PCR

Kvantifikace mRNA použití RT-PCR lze dosáhnout buď jako jednokrokovou nebo dvoustupňovou reakci. Rozdíl mezi těmito dvěma přístupy spočívá v počtu zkumavek použitých při provádění postupu. Dvoustupňová reakce vyžaduje, aby reakce reverzní transkriptázy a amplifikace PCR byly prováděny v oddělených zkumavkách. Nevýhodou dvoustupňového přístupu je náchylnost ke kontaminaci v důsledku častější manipulace se vzorky.[20] Na druhou stranu, celá reakce od syntézy cDNA k amplifikaci PCR probíhá v jedné zkumavce v jednokrokovém přístupu. Má se za to, že jednostupňový přístup minimalizuje experimentální variace tím, že obsahuje všechny enzymatické reakce v jediném prostředí. Eliminuje kroky pipetování produktu cDNA, který je pracný a náchylný ke kontaminaci, k reakci PCR. Další použití polymeráz tolerantních vůči inhibitorům, zesilovačů polymerázy s optimalizovanými jednokrokovými podmínkami RT-PCR, podporuje reverzní transkripci RNA z nepurifikovaných nebo surových vzorků, jako je například plná krev a sérum.[21][22] Výchozí templáty RNA jsou však v jednostupňovém přístupu náchylné k degradaci a použití tohoto přístupu se nedoporučuje, pokud jsou vyžadovány opakované testy ze stejného vzorku. Navíc se uvádí, že jednostupňový přístup je ve srovnání s dvoustupňovým přístupem méně přesný. Je to také upřednostňovaný způsob analýzy při použití barviv vázajících DNA, jako je SYBR Zelená od eliminace primer-dimery lze dosáhnout jednoduchou změnou v teplota tání. Jednokrokový přístup je nicméně relativně pohodlným řešením pro rychlou detekci cílové RNA přímo v biosensingu.[Citace je zapotřebí ]
End-point RT-PCR vs. RT-PCR v reálném čase
Kvantifikaci produktů RT-PCR lze z velké části rozdělit do dvou kategorií: koncový bod a reálný čas.[16] Použití end-point RT-PCR je preferováno pro měření změn genové exprese u malého počtu vzorků, ale RT-PCR v reálném čase se stala zlatou standardní metodou pro validaci výsledků získaných z maticových analýz nebo změn genové exprese na globálním měřítko.[23]
Konečný bod RT-PCR
Přístupy k měření end-point RT-PCR vyžadují detekci úrovní genové exprese pomocí fluorescenčních barviv ethidiumbromid,[24][25] P32 značení produktů PCR pomocí fosforimager,[26] nebo scintilační počítání.[19] End-point RT-PCR se běžně dosahuje pomocí tří různých metod: relativní, kompetitivní a srovnávací.[27][28]
- Relativní RT-PCR
- Relativní kvantifikace RT-PCR zahrnuje ko-amplifikaci vnitřní kontroly současně s požadovaným genem. Interní kontrola se používá k normalizaci vzorků. Po normalizaci lze provést přímé srovnání relativních četností transkriptů napříč několika vzorky mRNA. Je třeba si uvědomit, že vnitřní kontrola musí být zvolena tak, aby nebyla ovlivněna experimentální léčbou. Úroveň exprese by měla být konstantní napříč všemi vzorky as požadovanou mRNA, aby byly výsledky přesné a smysluplné. Protože kvantifikace výsledků je analyzována porovnáním lineárního rozsahu cílové a kontrolní amplifikace, je zásadní vzít v úvahu počáteční koncentraci cílových molekul a jejich rychlost amplifikace před zahájením analýzy. Výsledky analýzy jsou vyjádřeny jako poměry genového signálu k signálu vnitřní kontroly, které lze poté použít pro srovnání mezi vzorky při odhadu relativní exprese cílové RNA.[25][28][29]
- Konkurenční RT-PCR
- Pro absolutní kvantifikaci se používá technika kompetitivní RT-PCR. Zahrnuje použití syntetické „konkurenční“ RNA, kterou lze odlišit od cílové RNA malým rozdílem ve velikosti nebo sekvenci. Pro přesné výsledky je důležité, aby design syntetické RNA byl shodný v sekvenci, ale o něco kratší než cílová RNA. Jakmile je navrženo a syntetizováno, je do experimentálních vzorků přidáno známé množství konkurenční RNA a je společně amplifikováno s cílem pomocí RT-PCR. Poté se vytvoří křivka koncentrace konkurenční RNA a použije se k porovnání signálů RT-PCR produkovaných z endogenních transkriptů k určení množství cíle přítomného ve vzorku.[28][30]
- Srovnávací RT-PCR
- Srovnávací RT-PCR je podobná konkurenční RT-PCR v tom, že cílová RNA soutěží o amplifikační činidla v rámci jedné reakce s vnitřním standardem nepříbuzné sekvence. Jakmile je reakce dokončena, výsledky jsou porovnány s křivkou vnějšího standardu pro stanovení cílové koncentrace RNA. Ve srovnání s relativními a kompetitivními kvantifikačními metodami je srovnávací RT-PCR považována za nejvhodnější metodu pro použití, protože nevyžaduje, aby vyšetřovatel provedl pilotní experiment; v relativní RT-PCR musí být předem stanoven rozsah exponenciální amplifikace mRNA a v kompetitivní RT-PCR musí být syntetizována syntetická konkurenční RNA.[28][31][32][33][34]
RT-PCR v reálném čase
Vznik nových technik značení fluorescenční DNA v posledních několika letech umožnil analýzu a detekci produktů PCR v reálném čase a následně vedl k širokému přijetí RT-PCR v reálném čase pro analýzu genové exprese. Nejen, že RT-PCR v reálném čase je nyní metodou volby pro kvantifikaci genové exprese, je také preferovanou metodou pro získání výsledků z maticové analýzy a genové exprese v globálním měřítku. V současné době jsou k dispozici čtyři různé fluorescenční sondy DNA pro RT-PCR detekci produktů PCR v reálném čase: SYBR Zelená, TaqMan, molekulární majáky, a štír sondy. Všechny tyto sondy umožňují detekci produktů PCR generováním fluorescenčního signálu. Zatímco barvivo SYBR Green vydává svůj fluorescenční signál jednoduše vazbou na dvouvláknovou DNA v roztoku, generace fluorescence TaqMan sond, molekulárních majáků a štírů závisí na Försterův přenos rezonanční energie (FRET) kopulace molekuly barviva a zhášecí skupiny na oligonukleotidové substráty.[35]
- SYBR Zelená
- Když se SYBR Green váže na dvouvláknovou DNA produktů PCR, bude po excitaci emitovat světlo. Intenzita fluorescence se zvyšuje s akumulací produktů PCR. Tato technika je snadno použitelná, protože navrhování sond není nutné vzhledem k nespecifičnosti její vazby. Jelikož však barvivo nerozlišuje dvouvláknovou DNA od produktů PCR a od primer-dimerů, je nadhodnocení cílové koncentrace běžným problémem. Pokud je přesná kvantifikace absolutně nutná, musí být proveden další test pro validaci výsledků. Mezi metodami detekce produktů RT-PCR v reálném čase je však SYBR Green nejekonomičtější a nejsnadněji použitelný.[16][23]

- TaqMan sondy
- Sondy TaqMan jsou oligonukleotidy, které mají fluorescenční sondu připojenou k 5 'konci a zhášeč k 3' konci. Během PCR amplifikace budou tyto sondy hybridizovat s cílovými sekvencemi umístěnými v amplikon a protože polymeráza replikuje templát s navázaným TaqMan, také štěpí fluorescenční sondu díky aktivitě polymerázy 5'-nukleázy. Protože těsná blízkost mezi zhášecí molekulou a fluorescenční sondou obvykle brání detekci fluorescence pomocí FRET, výsledkem oddělení je zvýšení intenzity fluorescence úměrné počtu cyklů štěpení sondy. Ačkoli dobře navržené sondy TaqMan produkují přesné výsledky RT-PCR v reálném čase, je nákladné a časově náročné syntetizovat, když musí být pro každý analyzovaný cíl mRNA vytvořeny samostatné sondy.[16][17][36]
- Molekulární majákové sondy
- Podobně jako sondy TaqMan využívají molekulární majáky také detekci FRET s fluorescenčními sondami připojenými k 5 'konci a zhášečem připojeným k 3' konci oligonukleotidového substrátu. Zatímco však fluorescenční sondy TaqMan jsou během amplifikace štěpeny, sondy molekulárních majáků zůstávají nedotčené a během každého reakčního cyklu se znovu navazují na nový cíl. Pokud je roztok volný, těsná blízkost fluorescenční sondy a zhášecí molekuly brání fluorescenci přes FRET. Když však hybridizují sondy molekulárního majáku s cílem, fluorescenční barvivo a zhášeč se oddělí, což vede k emitování světla po excitaci. Stejně jako u sond TaqMan je syntéza molekulárních majáků nákladná a vyžadují samostatné sondy pro každý cíl RNA.[20]
- Scorpion sondy
- Scorpion sondy, stejně jako molekulární majáky, nebudou fluorescenční aktivní v nehybridizovaném stavu, opět kvůli fluorescenční sondě na 5 'konci, která je zhášena zbytkem na 3' konci oligonukleotidu. U Scorpions však 3 'konec také obsahuje sekvenci, která je komplementární s prodlužovacím produktem primeru na 5' konci. Když se rozšíření Scorpion naváže na svůj komplement na amplikonu, otevře se struktura Scorpion, zabrání FRET a umožní měření fluorescenčního signálu.[37]
- Multiplexní sondy
- Sondy TaqMan, molekulární majáky a škorpióny umožňují souběžné měření produktů PCR v jedné zkumavce. To je možné, protože každé z různých fluorescenčních barviv může být spojeno se specifickým emisním spektrem. Použití multiplexních sond nejen šetří čas a úsilí, aniž by byla ohrožena užitečnost testu, jeho použití v širokých oblastech výzkumu, jako je analýza delečních genů, analýza mutací a polymorfismu, kvantitativní analýza a detekce RNA, z ní činí neocenitelnou techniku pro laboratoře mnoho disciplíny.[37][38][39]
Ke kvantifikaci výsledků získaných pomocí RT-PCR v reálném čase se běžně používají dvě strategie; metoda standardní křivky a metoda srovnávací prahové hodnoty.[40]
aplikace
Exponenciální amplifikace pomocí polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí poskytuje vysoce citlivou techniku, při které lze detekovat velmi nízký počet kopií molekul RNA. RT-PCR se široce používá při diagnostice genetických onemocnění a semikvantitativně při stanovení množství specifických různých molekul RNA v buňce nebo tkáni jako měřítko genová exprese.
Metody výzkumu
RT-PCR se běžně používá ve výzkumných metodách k měření genové exprese. Například Lin a kol. použil qRT-PCR k měření exprese genů Gal v buňkách kvasinek. Nejprve Lin a kol. vytvořil mutaci proteinu, u kterého existuje podezření, že se účastní regulace genů Gal. O této mutaci se předpokládalo, že selektivně zruší Galovu expresi. Aby se to potvrdilo, hladiny genové exprese kvasinkových buněk obsahujících tuto mutaci byly analyzovány pomocí qRT-PCR. Vědci dokázali přesvědčivě určit, že mutace tohoto regulačního proteinu snížila expresi Gal.[41] Northern blot Analýza se používá k dalšímu studiu genové exprese RNA.
Vložení genu
RT-PCR může být také velmi užitečná při inzerci eukaryotický geny do prokaryoty. Protože většina eukaryotických genů obsahuje introny, které jsou přítomny v genomu, ale ne ve zralé mRNA, je cDNA generovaná reakcí RT-PCR přesnou (bez ohledu na povahu reverzních transkriptáz náchylnou k chybám) sekvenci DNA, která by byla přímo přeložena do protein po transkripce. Pokud jsou tyto geny exprimovány v prokaryotických buňkách kvůli produkci nebo čištění proteinu, nemusí být RNA produkovaná přímo z transkripce spojována, protože transkript obsahuje pouze exony. (Prokaryotům, jako je E. coli, chybí mechanismus sestřihu mRNA eukaryot).
Diagnóza genetické choroby
K diagnostice lze použít RT-PCR genetické onemocnění jako Lesch-Nyhanův syndrom. Toto genetické onemocnění je způsobeno poruchou funkce HPRT1 gen, který klinicky vede k fatálnímu močový kámen kyseliny močové a příznaky podobné dna.[6][je zapotřebí objasnění ] Analýza těhotné matky a plod pro úroveň exprese mRNA HPRT1 odhalí, zda je matka nositelkou a zda se u plodu pravděpodobně vyvine Lesch-Nyhanův syndrom.[42]
Detekce rakoviny
Vědci pracují na způsobech využití RT-PCR rakovina detekce, která pomůže zlepšit prognóza a sledovat reakci na terapii. V oběhu nádorové buňky produkují jedinečné transkripty mRNA v závislosti na typu rakoviny. Cílem je určit, které transkripty mRNA slouží jako nejlepší biomarkery pro konkrétní typ rakovinné buňky a poté analyzovat jeho hladiny exprese pomocí RT-PCR.[43]
RT-PCR se běžně používá při studiu genomů viry jejichž genomy jsou složeny z RNA, jako např Influenzavirus A, retroviry jako HIV a SARS-CoV-2 [44].
Výzvy
Přes své hlavní výhody není RT-PCR bez nevýhod. Exponenciální růst reverzní transkribované komplementární DNA (cDNA) během několika cyklů PCR produkuje nepřesnou kvantifikaci koncového bodu kvůli obtížnosti udržení linearity.[45] Aby se zajistila přesná detekce a kvantifikace obsahu RNA ve vzorku, byla vyvinuta qRT-PCR s použitím modifikace založené na fluorescenci pro monitorování amplifikačních produktů během každého cyklu PCR. Extrémní citlivostí této techniky může být dvojsečný meč, protože i sebemenší kontaminace DNA může vést k nežádoucím výsledkům.[46] Jednoduchou metodou pro eliminaci falešně pozitivních výsledků je zahrnutí kotev, nebo značky, do 5 'oblasti genově specifického primeru.[47] Kromě toho může být plánování a návrh kvantifikačních studií technicky náročné kvůli existenci mnoha zdrojů variací, včetně koncentrace templátu a účinnosti amplifikace.[31]
Protokol
![]() | Tato sekce je napsán jako manuál nebo průvodce.Srpna 2016) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) ( |
RT-PCR lze provádět pomocí jednokrokového protokolu RT-PCR nebo dvoustupňového protokolu RT-PCR.
Jednostupňová RT-PCR
Jednostupňová RT-PCR vezme mRNA cíle (až 6 kb) a podrobí je reverzní transkripci a poté amplifikaci PCR v jedné zkumavce. Pro dosažení nejlepších výsledků používejte pouze neporušenou vysoce kvalitní RNA. Ujistěte se, že používáte primer specifický pro sekvenci.
- Vyberte jednostupňovou soupravu RT-PCR, která by měla obsahovat směs s reverzní transkriptázou a systémem PCR, jako je Taq DNA polymeráza a korektura polymerázy.
- Získejte všechny potřebné materiály, vybavení a nástroje (soupravy by měly obsahovat podrobný seznam potřebných položek).
- Připravte reakční směs, která bude zahrnovat dNTP, primery, templátovou RNA, nezbytné enzymy a pufrovací roztok.
- Přidejte směs do zkumavky PCR pro každou reakci. Poté přidejte templátovou RNA.
- Umístěte zkumavky PCR do termálního cyklovače a začněte cyklovat. Prvním cyklem je reverzní transkripce k syntéze cDNA. Druhým cyklem je počáteční denaturace. Během tohoto cyklu je inaktivována reverzní transkriptáza. Dalších 40 až 50 cyklů je program amplifikace, který se skládá ze tří kroků: (1) denaturace, (2) žíhání, (3) prodloužení.
- Produkty RT-PCR lze poté analyzovat pomocí Gelová elektroforéza.[48][49]
(PCR Applications Manual and Biotools)
Dvoukroková RT-PCR
Dvoustupňová RT-PCR, jak název napovídá, probíhá ve dvou krocích. Nejprve reverzní transkripce a poté PCR. Tato metoda je citlivější než metoda v jednom kroku. Soupravy jsou také užitečné pro dvoustupňovou RT-PCR. Stejně jako v jednom kroku použijte pro dosažení nejlepších výsledků pouze neporušenou vysoce kvalitní RNA. Primer pro dvoustupňový nemusí být sekvenčně specifický.
Krok první
- Kombinujte templátovou RNA, primer, směs dNTP a vodu bez nukleáz v PCR zkumavce.
- Přidejte inhibitor PCR a reverzní transkriptázu do zkumavky PCR.
- Umístěte zkumavku PCR do termálního cyklovače na jeden cyklus, který zahrnuje žíhání, prodloužení a potom inaktivaci reverzní transkriptázy.
- Pokračujte přímo do PCR nebo skladujte na ledu, dokud nebude možné provést PCR.
Krok dva
- Přidat hlavní mix (obsahující pufr, směs dNTP, MgCl2Taq polymeráza a voda bez nukleáz) do každé zkumavky PCR.
- Přidejte vhodný primer.
- Umístěte zkumavky PCR do termálního cyklovače na 30 cyklů amplifikačního programu, který zahrnuje tři kroky: (1) denaturace (2) žíhání (3) prodloužení.
- Produkty RT-PCR lze poté analyzovat gelovou elektroforézou.[50]
Pokyny pro publikace
Kvantitativní RT-PCR test je považován za zlatý standard pro měření počtu kopií specifických cílů cDNA ve vzorku, ale je špatně standardizován.[51] Výsledkem je, že i když existuje řada publikací využívajících tuto techniku, mnohé poskytují nedostatečné experimentální podrobnosti a používají nevhodnou analýzu dat k vyvození nevhodných závěrů. Kvůli inherentní variabilitě v kvalitě jakýchkoli kvantitativních dat PCR mají recenzenti nejen obtížné hodnocení těchto rukopisů, ale také se studie nedají replikovat.[52] Uznávajíce potřebu standardizace hlášení experimentálních podmínek, Minimální informace pro publikaci kvantitativních experimentů PCR v reálném čase Pokyny (MIQE, vyslovuje se mykee) byly publikovány mezinárodním konsorciem akademických vědců. Pokyny MIQE popisují minimální informace nezbytné pro hodnocení kvantitativní PCR experimenty, které by měly být vyžadovány ke zveřejnění, aby se podpořila lepší experimentální praxe a zajistila relevantnost, přesnost, správná interpretace a opakovatelnost kvantitativních dat PCR.[53]
Kromě pokynů pro podávání zpráv zdůrazňuje MIQE potřebu standardizovat nomenklaturu spojenou s kvantitativní PCR, aby nedošlo k záměně; například, měla by se používat zkratka qPCR kvantitativní real-time PCR a RT-qPCR by měly být použity pro reverzní transkripci-qPCRa geny použité pro normalizaci by měly být označovány jako referenční geny místo geny pro úklid. Rovněž navrhuje, aby se komerčně odvozené termíny jako sondy TaqMan neměly používat, ale místo toho se označovaly jako hydrolyzační sondy. Dále se navrhuje, aby se k popisu PCR cyklu použitého pro kvantifikaci použil kvantifikační cyklus (Cq) místo prahového cyklu (Ct), bodu křížení (Cp) a bodu vzletu (TOP), které odkazují na stejnou hodnotu, ale byly vytvořený různými výrobci nástroje v reálném čase.[51]
Pokyny se skládají z následujících prvků: 1) experimentální návrh, 2) vzorek, 3) extrakce nukleových kyselin, 4) reverzní transkripce, 5) informace o cíli qPCR, 6) oligonukleotidy, 7) protokol, 8) validace a 9) data analýza. Specifické položky v každém prvku mají označení buď E (základní), nebo D (žádoucí). Ty označené E jsou považovány za kritické a nepostradatelné, zatímco ty označené D jsou považovány za okrajové, ale důležité pro osvědčené postupy.[53]
Reference
- ^ Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (Leden 1999). „Kvantitativní RT-PCR: úskalí a potenciál“. Biotechniky. 26 (1): 112–22, 124–5. doi:10.2144 / 99261rv01. PMID 9894600.
- ^ Mackay, Ian (2007). PCR v reálném čase v mikrobiologii: od diagnostiky k charakterizaci. Norfolk, Anglie: Caister Academic Press. str.440. ISBN 978-1-904455-18-9.
- ^ Joyce C (2002). Kvantitativní RT-PCR. Přehled současných metodik. Methods Mol. Biol. 193. 83–92. doi:10.1385 / 1-59259-283-X: 083. ISBN 978-1-59259-283-8. PMID 12325527.
- ^ Kang XP, Jiang T, Li YQ a kol. (2010). „Duplexní RT-PCR test v reálném čase pro detekci viru ptačí chřipky H5N1 a pandemického viru chřipky H1N1“. Virol. J. 7: 113. doi:10.1186 / 1743-422X-7-113. PMC 2892456. PMID 20515509.
- ^ A b Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (červen 2005). "Kvantitativní RT-PCR v reálném čase - perspektiva". J. Mol. Endokrinol. 34 (3): 597–601. CiteSeerX 10.1.1.528.6638. doi:10.1677 / jme.1.01755. PMID 15956331.
- ^ Varkonyi-Gasic E, Hellens RP (2010). „qRT-PCR malých RNA“. Epigenetika rostlin. Metody v molekulární biologii. 631. 109–22. doi:10.1007/978-1-60761-646-7_10. ISBN 978-1-60761-645-0. PMID 20204872.
- ^ Taylor S, Wakem M, Dijkman G, Alsarraj M, Nguyen M (duben 2010). „Praktický přístup k publikování dat RT-qPCR, který odpovídá směrnicím MIQE“. Metody. 50 (4): S1–5. doi:10.1016 / j.ymeth.2010.01.005. PMID 20215014.
- ^ Spackman E, Senne DA, Myers TJ a kol. (Září 2002). „Vývoj testu reverzní transkriptázy v reálném čase pro virus chřipky typu A a ptačí podtypy H5 a H7 hemaglutininu“. J. Clin. Microbiol. 40 (9): 3256–60. doi:10,1128 / jcm.40.9.3256-3260.2002. PMC 130722. PMID 12202562.
- ^ „ZRYCHLENÉ NÚDZOVÉ AUTORIZACE POUŽITÍ (EUA) SOUHRN ZKOUŠKY COVID-19 RT-PCR (LABORATORNÍ KORPORACE AMERIKY)“. FDA. Citováno 3. dubna 2020.
- ^ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (prosinec 1977). "Metoda pro detekci specifických RNA v agarózových gelech přenosem na diazobenzyloxymethylový papír a hybridizací s DNA sondami". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74 (12): 5350–4. Bibcode:1977PNAS ... 74.5350A. doi:10.1073 / pnas.74.12.5350. PMC 431715. PMID 414220.
- ^ Streit S, Michalski CW, Erkan M, Kleeff J, Friess H (2009). "Northern blot analýza pro detekci a kvantifikaci RNA v buňkách a tkáních rakoviny pankreatu". Nat Protoc. 4 (1): 37–43. doi:10.1038 / nprot.2008.216. PMID 19131955.
- ^ Bustin SA (říjen 2000). „Absolutní kvantifikace mRNA pomocí testů polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí v reálném čase“. J. Mol. Endokrinol. 25 (2): 169–93. doi:10.1677 / jme.0.0250169. PMID 11013345.
- ^ Hierro N, Esteve-Zarzoso B, González A, Mas A, Guillamón JM (listopad 2006). „Kvantitativní PCR v reálném čase (QPCR) a reverzní transkripce-QPCR pro detekci a stanovení počtu celkových kvasinek ve víně“. Appl. Environ. Microbiol. 72 (11): 7148–55. doi:10.1128 / AEM.00388-06. PMC 1636171. PMID 17088381.
- ^ Slomka MJ, Pavlidis T, Coward VJ a kol. (Červenec 2009). „Ověřené metody PCR pro reverzní transkriptázu RealTime pro diagnostiku a patotypizaci virů ptačí chřipky H7“. Chřipka Další viry Respi. 3 (4): 151–64. doi:10.1111 / j.1750-2659.2009.00083.x. PMC 4634683. PMID 19627372.
- ^ Shrnutí mise: Terénní návštěva WHO ve Wu-chanu v Číně 20. – 21. Ledna 2020: https://www.who.int/china/news/detail/22-01-2020-field-visit-wuhan-china-jan-2020
- ^ A b C d Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW (říjen 2000). „Kvantitativní řetězová reakce s reverzní transkripcí a polymerázou ke studiu rozpadu mRNA: srovnání koncových bodů a metod v reálném čase“. Anální. Biochem. 285 (2): 194–204. doi:10.1006 / abio.2000.4753. PMID 11017702. S2CID 258810.
- ^ A b Deepak S, Kottapalli K, Rakwal R a kol. (Červen 2007). „PCR v reálném čase: revoluční detekce a analýza exprese genů“. Curr. Genomika. 8 (4): 234–51. doi:10.2174/138920207781386960. PMC 2430684. PMID 18645596.
- ^ A b Bustin SA (srpen 2002). „Kvantifikace mRNA pomocí reverzní transkripční PCR v reálném čase (RT-PCR): trendy a problémy“. J. Mol. Endokrinol. 29 (1): 23–39. doi:10.1677 / jme.0.0290023. PMID 12200227.
- ^ A b Souazé F, Ntodou-Thomé A, Tran CY, Rostène W, Forgez P (srpen 1996). „Kvantitativní RT-PCR: limity a přesnost“. Biotechniky. 21 (2): 280–5. doi:10.2144 / 96212rr01. PMID 8862813.
- ^ A b Wong ML, Medrano JF (červenec 2005). „PCR v reálném čase pro kvantifikaci mRNA“. Biotechniky. 39 (1): 75–85. doi:10.2144 / 05391rv01. PMID 16060372.
- ^ Li, Lang; On, Jian-an; Wang, Wei; Xia, Yun; Song, Li; Chen, Ze-han; Zuo, Hang-zhi; Tan, Xuan-Ping; Ho, Aaron Ho-Pui; Kong, Siu-Kai; Loo, Jacky Fong-Chuen (01.08.2019). „Vývoj přímé kvantitativní PCR s reverzní transkripcí (dirRT-qPCR) pro klinickou diagnózu Zika“. International Journal of Infection Diseases. 85: 167–174. doi:10.1016 / j.ijid.2019.06.007. ISSN 1201-9712. PMID 31202908.
- ^ Bachofen, Claudia; Willoughby, Kim; Zadoks, Ruth; Burr, Paul; Mellor, Dominic; Russell, George C. (2013-06-01). „Přímá RT-PCR ze séra umožňuje rychlou a nákladově efektivní fylogenetickou analýzu viru bovinního virového průjmu“. Journal of Virological Methods. 190 (1): 1–3. doi:10.1016 / j.jviromet.2013.03.015. ISSN 0166-0934. PMID 23541784.
- ^ A b Rajeevan MS, Vernon SD, Taysavang N, Unger ER (únor 2001). „Ověření profilů genové exprese založených na poli pomocí kinetické RT-PCR v reálném čase“. J Mol Diagn. 3 (1): 26–31. doi:10.1016 / S1525-1578 (10) 60646-0. PMC 1907344. PMID 11227069.
- ^ Stone-Marschat M, Carville A, Skowronek A, Laegreid WW (březen 1994). „Detekce viru moru koní pomocí reverzní transkripce-PCR“. J. Clin. Microbiol. 32 (3): 697–700. doi:10.1128 / JCM.32.3.697-700.1994. PMC 263109. PMID 8195381.
- ^ A b Minton AP (duben 1995). "Uzavření jako determinant makromolekulární struktury a reaktivity. II. Účinky slabě atraktivních interakcí mezi omezenými makrosolutami a omezujícími strukturami". Biophys. J. 68 (4): 1311–22. Bibcode:1995 BpJ .... 68,1311 mil. doi:10.1016 / S0006-3495 (95) 80304-8. PMC 1282026. PMID 7787020.
- ^ Hsu M, Yu EY, Sprušanský O, McEachern MJ, Lue NF (červenec 2012). „Funkční analýza jediného homologu Est1 / Ebs1 v Kluyveromyces lactis odhaluje role jak v udržování telomer, tak v odolnosti vůči rapamycinu.“. Eukaryotická buňka. 11 (7): 932–42. doi:10.1128 / EC.05319-11. PMC 3416500. PMID 22544908.
- ^ Schmittgen TD, Livak KJ (2008). "Analýza dat PCR v reálném čase srovnávací metodou C (T)". Nat Protoc. 3 (6): 1101–8. doi:10.1038 / nprot.2008.73. PMID 18546601.
- ^ A b C d Tang, Yi-Wei (2012-09-13), Pokročilé techniky v diagnostické mikrobiologii, ISBN 978-1461439691
- ^ Gause WC, Adamovicz J (červen 1994). „Použití PCR ke kvantifikaci genové exprese“. Appl. Metody PCR. 3 (6): S123–35. doi:10,1101 / gr.3.6.s123. PMID 7522722.
- ^ Tsai SJ, Wiltbank MC (listopad 1996). „Kvantifikace mRNA pomocí kompetitivní RT-PCR s metodikou standardní křivky“. Biotechniky. 21 (5): 862–6. doi:10.2144 / 96215st04. PMID 8922627.
- ^ A b Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF (březen 2003). "Analýza předpokladů kvantitativních dat polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase". Neurosci. Lett. 339 (1): 62–6. doi:10.1016 / S0304-3940 (02) 01423-4. PMID 12618301.
- ^ Halford WP, Falco VC, Gebhardt BM, Carr DJ (leden 1999). "Vlastní kvantitativní kapacita reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce". Anální. Biochem. 266 (2): 181–91. doi:10.1006 / abio.1998.2913. PMID 9888974.
- ^ Král N (2010). „Použití srovnávací kvantitativní RT-PCR ke zkoumání účinku inkubace cysteinu na expresi GPx1 v čerstvě izolovaných kardiomyocytech“. Protokoly RT-PCR. Metody v molekulární biologii. 630. 215–32. doi:10.1007/978-1-60761-629-0_14. ISBN 978-1-60761-628-3. PMID 20301000.
- ^ Chang JT, Chen IH, Liao CT a kol. (Listopad 2002). „Reverzní transkripční komparativní metoda PCR v reálném čase pro kvantitativní detekci angiogenních růstových faktorů u pacientů s rakovinou hlavy a krku“. Clin. Biochem. 35 (8): 591–6. doi:10.1016 / S0009-9120 (02) 00403-4. PMID 12498992.
- ^ Holden, M. J .; Wang, L. (2008). „Kvantitativní real-time PCR: Možnosti a problémy s fluorescenční sondou“. Standardizace a zajištění kvality v měření fluorescence II. Springerova řada o fluorescenci. 6. str. 489. doi:10.1007/4243_2008_046. ISBN 978-3-540-70570-3.
- ^ Yang DK, Kweon CH, Kim BH a kol. (Prosinec 2004). „TaqMan reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce pro detekci viru japonské encefalitidy“. J. Vet. Sci. 5 (4): 345–51. doi:10.4142 / jvs.2004.5.4.345. PMID 15613819.
- ^ A b Sharkey FH, Banat IM, Marchant R (červenec 2004). "Detekce a kvantifikace genové exprese v bakteriologii prostředí". Appl. Environ. Microbiol. 70 (7): 3795–806. doi:10.1128 / AEM.70.7.3795-3806.2004. PMC 444812. PMID 15240248.
- ^ Ratcliff RM, Chang G, Kok T, Sloots TP (červenec 2007). "Molekulární diagnostika lékařských virů". Curr Issues Mol Biol. 9 (2): 87–102. PMID 17489437.
- ^ Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE (říjen 2000). „Multiplexní PCR: optimalizace a aplikace v diagnostické virologii“. Clin. Microbiol. Rev. 13 (4): 559–70. doi:10,1128 / cmr. 13.4.559-570.2000. PMC 88949. PMID 11023957.
- ^ Bustin SA (červenec 2005). „Kvantitativní PCR v reálném čase na základě fluorescence: snímek současných postupů a preferencí“. Expert Rev. Mol. Diagn. 5 (4): 493–8. doi:10.1586/14737159.5.4.493. PMID 16013967. S2CID 1833811.
- ^ Lin L, Chamberlain L, Zhu LJ, Green MR (únor 2012). „Analýza aktivace transkripce řízené Gal4 pomocí mutantů Tra1 selektivně defektních pro interakci s Gal4“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (6): 1997–2002. Bibcode:2012PNAS..109.1997L. doi:10.1073 / pnas.1116340109. PMC 3277556. PMID 22308403.
- ^ Torres RJ, Garcia MG, Puig JG (prosinec 2012). „Nosná a prenatální diagnostika Lesch-Nyhanovy choroby v důsledku poruchy regulace exprese genu HPRT“. Gen. 511 (2): 306–7. doi:10.1016 / j.gene.2012.09.121. PMID 23046577.
- ^ Xi L, Nicastri DG, El-Hefnawy T, Hughes SJ, Luketich JD, Godfrey TE (červenec 2007). „Optimální markery pro detekci kvantitativní reverzní transkripce PCR v reálném čase u cirkulujících nádorových buněk z rakoviny melanomu, prsu, tlustého střeva, jícnu, hlavy a krku a plic“. Clin. Chem. 53 (7): 1206–15. doi:10.1373 / clinchem.2006.081828. PMID 17525108.
- ^ „Coronavirus: il viaggio dei test“. Istituto Superiore di Sanità.
- ^ Shiao YH (prosinec 2003). „Nová metoda reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce pro přesnou kvantifikaci“. BMC Biotechnol. 3: 22. doi:10.1186/1472-6750-3-22. PMC 317330. PMID 14664723.
- ^ Gettemy JM, Ma B, Alic M, Gold MH (únor 1998). "Reverzní transkripční-PCR analýza regulace rodiny genů manganové peroxidázy". Appl. Environ. Microbiol. 64 (2): 569–74. doi:10.1128 / AEM.64.2.569-574.1998. PMC 106084. PMID 9464395.
- ^ Martel, Fatima; Dirk Grundemann; Edgar Schöig (31.03.2002). "Jednoduchá metoda pro eliminaci falešně pozitivních výsledků v RT-PCR". J Biochem Mol Biol. 35 (2): 248–250. doi:10,5483 / BMBRep.2002.35.2.248. PMID 12297038.
- ^ „Sada OneStep Kit s vysokým přepisem“. Biotools. Archivovány od originál dne 20. května 2013. Citováno 12. prosince 2012.
- ^ Degen, Hans-Joachim; Deufel, Annette; Eisel, Doris; Grünewald-Janho, Stefanie; Keesey, Joe (2006). Příručka k aplikacím PCR (PDF) (3. vyd.). Roche Diagnostics. str. 135–137.
- ^ „Dvoukrokový protokol RT-PCR“ (PDF). MIT. Citováno 12. prosince 2012.
- ^ A b „www.microarrays.ca“ (PDF).
- ^ Bustin SA (duben 2010). "Proč je třeba vydat pokyny pro publikaci qPCR? - Případ MIQE". Metody. 50 (4): 217–26. doi:10.1016 / j.ymeth.2009.12.006. PMID 20025972.
- ^ A b Bustin SA, Benes V, Garson JA a kol. (Duben 2009). „Pokyny MIQE: minimální informace pro publikaci kvantitativních experimentů PCR v reálném čase“. Clin. Chem. 55 (4): 611–22. doi:10.1373 / clinchem.2008.112797. PMID 19246619.