Taq polymeráza - Taq polymerase

DNA polymeráza I, termostabilní
PDB 1ktq EBI.jpg
Velký (Klenow) fragment Taq polA, obsahující polA a zakrnělé domény
Identifikátory
OrganismusThermus aquaticus
SymbolpolA
UniProtP19821

Taq polymeráza je termostabilní DNA polymeráza I pojmenoval podle termofilní eubakteriální mikroorganismus Thermus aquaticus, ze kterého byl původně izolován Chien et al. v roce 1976.[1] Jeho jméno je často zkráceno na Taq nebo Taq pol. Často se používá v polymerázová řetězová reakce (PCR), metoda velkého zesílení množství krátkých segmentů DNA.

T. aquaticus je bakterie který žije v horké prameny a hydrotermální průduchy, a Taq byla identifikována polymeráza[1] jako enzym schopen odolat podmínkám denaturace proteinů (vysoká teplota) požadovaným během PCR.[2] Proto nahradila DNA polymerázu z E-coli původně použitý v PCR.[3]

Enzymatické vlastnosti

Taq 's optimální teplota pro aktivita je 75–80 ° C, s a poločas rozpadu více než 2 hodiny při 92,5 ° C, 40 minut při 95 ° C a 9 minut při 97,5 ° C, a může replikovat 1000 základní pár řetězec DNA za méně než 10 sekund při 72 ° C.[4] Při 75-80 ° C, Taq dosáhne svého optima polymerizace míra asi 150 nukleotidy za sekundu na molekulu enzymu a jakékoli odchylky od optimálního teplotního rozsahu inhibují rychlost extenze enzymu. Jediný Taq syntetizuje přibližně 60 nukleotidů za sekundu při 70 ° C, 24 nukleotidů / s při 55 ° C, 1,5 nukleotidů / s při 37 ° C a 0,25 nukleotidů / s při 22 ° C. Při teplotách nad 90 ° C Taq vykazuje velmi malou nebo žádnou aktivitu, ale samotný enzym nedenaturuje a zůstává nedotčen.[5] Přítomnost jisté ionty v reakční nádobě také ovlivňuje specifickou aktivitu enzymu. Malé množství chlorid draselný (KCl) a hořčík ion (Mg2+) propagovat Taqenzymatická aktivita. Taq polymeráza se maximálně aktivuje při 50 mM KCl a správné koncentraci Mg2+ který je určen koncentrací nukleosid trifosfáty (dNTP). Vysoké koncentrace KCl a Mg2+ inhibovat Taqaktivita.[6] Zajímavé je, že běžný chelátor iontů kovů, EDTA, se přímo váže na Taq v nepřítomnosti těchto kovových iontů.[7]

Jeden z Taq 'Nevýhodou je jeho nedostatek 3' na 5' exonukleáza korektura aktivita[4] což má za následek relativně nízkou věrnost replikace. Původně byla jeho chybovost měřena na přibližně 1 z 9 000 nukleotidů.[8] Některé termostabilní DNA polymerázy byly izolovány z jiných termofilních bakterií a archea, jako jsou např Pfu DNA polymeráza, které mají korektury, a jsou používány místo (nebo v kombinaci s) Taq pro vysoce věrné zesílení.[9] Věrnost se může mezi Taq velmi lišit, což má hluboké účinky v aplikacích pro následné sekvenování.[10]

Taq vyrábí produkty DNA, které mají A (adenin ) převisy na jejich 3 'koncích. To může být užitečné v Klonování TA, přičemž a klonovací vektor (například a plazmid ), který má T (tymin ) Používá se 3 'přesah, který doplňuje A přesah produktu PCR, čímž umožňuje ligace PCR produktu do plazmidového vektoru.

V PCR

Na začátku 80. let Kary Mullis pracoval u Cetus Corporation o aplikaci syntetických DNA na biotechnologie. Znal použití DNA oligonukleotidy jako sondy pro navázání na cílové řetězce DNA, stejně jako jejich použití jako primery pro Sekvenování DNA a cDNA syntéza. V roce 1983 začal používat dva primery, jeden pro hybridizovat ke každému řetězci cílové DNA a přidání DNA polymeráza k reakci. To vedlo k exponenciálu replikace DNA,[11] výrazně zesilující diskrétní segmenty DNA mezi primery.[3]

Po každém replikačním cyklu je však nutné směs zahřát na teplotu vyšší než 90 ° C denaturace nově vytvořená DNA, umožňující oddělit řetězce a působit jako šablony v dalším kole amplifikace. Tento krok zahřívání také inaktivuje DNA polymerázu, která byla používána před objevením Taq polymeráza, Klenowův fragment (zdroj z E-coli ). Taq polymeráza je pro tuto aplikaci vhodná, protože je schopna odolat teplotě 95 ° C, která je požadována pro separaci řetězců DNA bez denaturace.

Použití termostabilní Taq umožňuje spuštění PCR při vysoké teplotě (~ 60 ° C a vyšší), což usnadňuje vysokou specificitu primerů a snižuje produkci nespecifických produktů, jako je dimer primeru. Použití termostabilní polymerázy také eliminuje potřebu přidávat nový enzym do každého kola termocyklování. Jedna uzavřená trubice v relativně jednoduché stroj lze použít k provedení celého procesu. Tedy použití Taq polymeráza byla klíčovou myšlenkou, díky které byla PCR použitelná pro širokou škálu molekulární biologie problémy týkající se analýzy DNA.[2]

Patentové záležitosti

Hoffmann-La Roche nakonec koupil PCR a Taq patenty od společnosti Cetus za 330 milionů dolarů, z čehož mohla získat licenční poplatky až 2 miliardy dolarů.[12] V roce 1989 Vědecký časopis pojmenovaný Taq první polymeráza "Molekula roku ". Kary Mullis obdržel Nobelova cena za chemii v roce 1993 jako jediný oceněn za výzkum prováděný na a biotechnologie společnost. Na počátku 90. let byla technika PCR s Taq polymeráza se používala v mnoha oblastech, včetně základního výzkumu molekulární biologie, klinické testování, a forenzní. Rovněž začalo hledat naléhavou aplikaci pro přímou detekci HIV v AIDS.[13]

V prosinci 1999 americký okresní soudce Vaughn Walker rozhodl, že patent z roku 1990 zahrnuje Taq polymeráza byla vydána částečně na zavádějících informacích a falešných tvrzeních vědců s Cetus Corporation. Rozhodnutí podpořilo výzvu od Promega Corporation proti Hoffman-La Roche, který koupil Taq patenty v roce 1991. Soudce Walker citoval předchozí objevy jiných laboratoří, včetně laboratoře profesora John Trela v University of Cincinnati oddělení biologických věd, jako základ rozhodnutí.[14]

Struktura domény

Taq polymeráza, exonukleáza
Taq.png
Úplný Taq DNA polymeráza navázaná na oktamer DNA
Identifikátory
SymbolTaq-exonuc
PfamPF09281
InterProIPR015361
SCOP21 m2 / Rozsah / SUPFAM

Taq PolA má celkovou strukturu podobnou struktuře E-coli PolA. Střední doména 3'– 5 'exonukleázy odpovědná za korektury byla dramaticky změněna a není funkční.[15] Má funkční 5'-3 'exonukleázovou doménu na aminoterminále, jak je popsáno níže. Zbývající dvě domény působí v koordinaci prostřednictvím pohybu spojené domény.[16]

Exonukleázová doména

Taq polymerázová exonukleáza je doména nacházející se na amino-konci Taq DNA polymeráza I (termostabilní). Předpokládá a ribonukleáza H-jako motiv. Doména uděluje 5 '-3' exonukleáza aktivita na polymerázu.[17]

Na rozdíl od stejné domény v E-coli, které by degradovaly primery a musí být odstraněny štěpením pro použití PCR,[9] není řečeno, že tato doména degraduje primer.[18] Tato aktivita se používá v TaqMan sonda: při vytváření dceřiných řetězců přicházejí sondy komplementární k templátu do styku s polymerázou a štěpí se na fluorescenční kousky.[19]

Vazba s DNA

Taq polymeráza je navázána na štěrbinu aktivního místa polymerázy s tupým koncem duplexní DNA. Jako Taq polymeráza je v kontaktu s navázanou DNA, její boční řetězce tvoří vodíkové vazby s puriny a pyrimidiny DNA. Stejná oblast Taq polymeráza, která se navázala na DNA, se také váže s exonukleázou. Tyto struktury vázané na Taq polymerázy mají různé interakce.

Mutanti

A místně zaměřená mutageneze byl popsán experiment, který zlepšuje zakrnělou aktivitu 3'-5 'exonukleázy o faktor 2, ale nikdy nebyl hlášen, zda by to snížilo míru chyb.[20] Po podobné myšlenkové linii byly chimérické proteiny vyrobeny doménami sběru třešní z E-coli, Taq, a T. neapolitana polymeráza I. Výměna zbytkové domény za funkční z E-coli vytvořil protein s odolností proti čtení, ale s nižší optimální teplotou a nízkou termostabilitou.[21]

Byly vyrobeny verze polymerázy bez 5'-3 'exonukleázové domény Klentaq nebo Stoffel fragment jsou nejznámější. Úplný nedostatek exonukleázové aktivity činí tyto varianty vhodné pro primery, které vykazují sekundární strukturu, stejně jako pro kopírování kruhových molekul.[9] Mezi další varianty patří použití Klentaq s vysoce věrnou polymerázou, a Termosekvenáza který rozpoznává substráty jako T7 DNA polymeráza ano, mutanty s vyšší tolerancí k inhibitorům nebo verze označené doménou, které mají navíc spirála-vlásenka-spirála motiv kolem katalytického místa, aby i přes nepříznivé podmínky držela DNA pevněji.[22]

Taq Polymeráza

Význam při detekci nemocí

Z důvodu vylepšení Taq polymeráza poskytovaná při replikaci PCR DNA: vyšší specificita, méně nespecifických produktů a jednodušší procesy a zařízení, pomohla při úsilí o detekci nemocí. „Použití polymerázové řetězové reakce (PCR) při diagnostice infekčních chorob vedlo ke schopnosti diagnostikovat včas a vhodně léčit nemoci způsobené náročnými patogeny, určit antimikrobiální citlivost pomalu rostoucích organismů a zjistit kvantitu infekce.“ [23] Implementace Taq polymeráza zachránila nespočet životů. Sloužil zásadní roli při detekci mnoha nejhorších chorob na světě, včetně: tuberkulózy, streptokokové faryngitidy, atypické pneumonie, AIDS, spalniček, hepatitidy a ulcerózních urogenitálních infekcí. PCR, metoda používaná k opětovnému vytvoření kopií specifických vzorků DNA, umožňuje detekci nemoci tím, že cílí na konkrétní sekvenci DNA cíleného patogenu ze vzorku pacienta a amplifikuje stopová množství indikativních sekvencí jejich kopií až miliardkrát. I když se jedná o nejpřesnější metodu detekce nemoci, zejména u HIV, neprovádí se tak často jako alternativní, horší testy z důvodu relativně vysokých nákladů, práce a času.[24]

Spoléhání se na Taq polymeráza jako katalyzátor pro proces replikace PCR byla zdůrazněna během pandemie COVID-19 v roce 2020. Nedostatek potřebného enzymu narušil schopnost zemí po celém světě vyrábět testovací soupravy na virus. Bez Taq polymerázy je proces detekce nemocí mnohem pomalejší a zdlouhavější.[25]

Přes výhody používání Taq polymeráza v detekci nemoci PCR, enzym není bez nedostatků. Retrovirová onemocnění: HIV, HTLV-1 a HTLV-II; často zahrnují mutace od guaninu po adenin ve svém genomu. Mutace, jako jsou tyto, umožňují PCR testy detekovat onemocnění, ale Taq Relativně nízká míra věrnosti polymerázy vede ke vzniku stejné mutace G-A-A a pravděpodobně vede k falešně pozitivnímu výsledku testu.[26]

Viz také

Reference

  1. ^ A b Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM (září 1976). „Polymeráza deoxyribonukleové kyseliny z extrémního termofilu Thermus aquaticus“. Journal of Bacteriology. 127 (3): 1550–7. doi:10.1128 / jb.127.3.1550-1557.1976. PMC  232952. PMID  8432.
  2. ^ A b Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT a kol. (Leden 1988). "Primerem řízená enzymatická amplifikace DNA termostabilní DNA polymerázou". Věda. 239 (4839): 487–91. Bibcode:1988Sci ... 239..487S. doi:10.1126 / science.239.4839.487. PMID  2448875.[trvalý mrtvý odkaz ]
  3. ^ A b Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N (prosinec 1985). „Enzymatická amplifikace genomových sekvencí beta-globinu a analýza restrikčních míst pro diagnostiku srpkovité anémie“. Věda. 230 (4732): 1350–4. Bibcode:1985Sci ... 230.1350S. doi:10.1126 / science.2999980. PMID  2999980. Archivovány od originál dne 2008-12-19.
  4. ^ A b Právník FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH (květen 1993). „Vysoká úroveň exprese, čištění a enzymatická charakterizace DNA polymerázy Thermus aquaticus plné délky a zkrácené formy s deficitem aktivity 5 'až 3' exonukleázy.". Metody a aplikace PCR. 2 (4): 275–87. doi:10,1101 / gr. 2.4.275. PMID  8324500.
  5. ^ Protokoly PCR: průvodce metodami a aplikacemi. Innis, Michael A. San Diego: Academic Press. 1990. ISBN  978-0123721808. OCLC  19723112.CS1 maint: ostatní (odkaz)
  6. ^ Technologie PCR: principy a aplikace pro amplifikaci DNA. Erlich, Henry A., 1943-. New York: Stockton Press. 1989. ISBN  978-0333489482. OCLC  19323242.CS1 maint: ostatní (odkaz)
  7. ^ Lopata A, Jójárt B, Surányi ÉV, Takács E, Bezúr L, Leveles I a kol. (Říjen 2019). „Beyond Chelation: EDTA Tightly Binds Taq DNA Polymerase, MutT and dUTPase and Directly Inhibits dNTPase Activity“. Biomolekuly. 9 (10): 621. doi:10,3390 / biom9100621. PMC  6843921. PMID  31627475.
  8. ^ Tindall KR, Kunkel TA (srpen 1988). "Věrnost syntézy DNA Thermus aquaticus DNA polymerázou". Biochemie. 27 (16): 6008–13. doi:10.1021 / bi00416a027. PMID  2847780.
  9. ^ A b C van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (2008). "Taq a další termostabilní DNA polymerázy". Principy a technické aspekty amplifikace PCR. 103–18. doi:10.1007/978-1-4020-6241-4_7. ISBN  978-1-4020-6240-7.
  10. ^ Brandariz-Fontes C, Camacho-Sanchez M, Vilà C, Vega-Pla JL, Rico C, Leonard JA (leden 2015). „Vliv podmínek enzymu a PCR na kvalitu vysoce výkonných výsledků sekvenování DNA“. Vědecké zprávy. 5: 8056. Bibcode:2015NatSR ... 5E8056B. doi:10.1038 / srep08056. PMC  4306961. PMID  25623996.
  11. ^ Mullis KB (duben 1990). "Neobvyklý původ polymerázové řetězové reakce". Scientific American. 262 (4): 56–61, 64–5. Bibcode:1990SciAm.262d..56M. doi:10.1038 / scientificamerican0490-56. PMID  2315679.
  12. ^ Fore J, Wiechers IR, Cook-Deegan R (červenec 2006). „Dopady obchodních praktik, licencí a duševního vlastnictví na vývoj a šíření polymerázové řetězové reakce: případová studie“. Journal of Biomedical Discovery and Collaboration. 1: 7. doi:10.1186/1747-5333-1-7. PMC  1523369. PMID  16817955.
    Podrobná historie společnosti Cetus Corporation a komerční aspekty PCR.
  13. ^ Guatelli JC, Gingeras TR, Richman DD (duben 1989). „Amplifikace nukleové kyseliny in vitro: detekce sekvencí s nízkým počtem kopií a aplikace na diagnostiku infekce virem lidské imunodeficience typu 1“. Recenze klinické mikrobiologie. 2 (2): 217–26. doi:10.1128 / CMR.2.2.217. PMC  358112. PMID  2650862.
  14. ^ Curran, Chris, Bio-Medicine, 7. prosince 1999
  15. ^ Eom SH, Wang J, Steitz TA (červenec 1996). "Struktura Taq polymerázy s DNA v aktivním místě polymerázy". Příroda. 382 (6588): 278–81. Bibcode:1996 Natur.382..278E. doi:10.1038 / 382278a0. PMID  8717047.
  16. ^ Bu Z, Biehl R, Monkenbusch M, Richter D, Callaway DJ (prosinec 2005). „Pohyb vázané proteinové domény v Taq polymeráze odhalen neutronovou spin-echo spektroskopií“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 102 (49): 17646–51. Bibcode:2005PNAS..10217646B. doi:10.1073 / pnas.0503388102. PMC  1345721. PMID  16306270.
  17. ^ Li Y, Mitaxov V, Waksman G (srpen 1999). „Strukturovaný design Taq DNA polymeráz se zlepšenými vlastnostmi začlenění dideoxynukleotidu“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 96 (17): 9491–6. Bibcode:1999PNAS ... 96,9491L. doi:10.1073 / pnas.96.17.9491. PMC  22236. PMID  10449720.
  18. ^ "Zhorší 5 '→ 3' chlopenní endonukleázová aktivita Taq DNA polymerázy degradaci primerů?". NEB. Citováno 28. března 2019.
  19. ^ Genový výraz TaqMan - projekty NCBI
  20. ^ Park Y, Choi H, Lee DS, Kim Y (červen 1997). "Zlepšení 3'-5 'exonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy proteinovým inženýrstvím v aktivním místě". Molekuly a buňky. 7 (3): 419–24. PMID  9264032.
  21. ^ Villbrandt B, Sobek H, Frey B, Schomburg D (září 2000). „Výměna domén: chiméry DNA polymerázy Thermus aquaticus, DNA polymerázy I z Escherichia coli a DNA polymerázy Thermotoga neapolitana“. Proteinové inženýrství. 13 (9): 645–54. doi:10.1093 / protein / 13.9.645. PMID  11054459.
  22. ^ Ishino S, Ishino Y (2014). „DNA polymerázy jako užitečná činidla pro biotechnologie - historie vývojového výzkumu v oboru“. Hranice v mikrobiologii. 5: 465. doi:10.3389 / fmicb.2014.00465. PMC  4148896. PMID  25221550.
  23. ^ Menon PK, Kapila K, Ohri VC (červenec 1999). „Polymerázová řetězová reakce a pokrok v diagnostice infekčních nemocí“. Medical Journal, ozbrojené síly Indie. 55 (3): 229–231. doi:10.1016 / S0377-1237 (17) 30450-1. PMC  5531883. PMID  28775636.
  24. ^ „Polymerázová řetězová reakce (PCR)“. stanfordhealthcare.org. Citováno 2020-04-23.
  25. ^ „Šéf FDA varuje před„ tlakem “dodávek reagencií pro testy na koronaviry“. MedTech Dive. Citováno 2020-04-23.
  26. ^ Overbaugh J, Jackson SM, MD Papenhausen, Rudensey LM (listopad 1996). „Lentivirové genomy s hypermutací G-to-A mohou být výsledkem chyb Taq polymerázy během polymerázové řetězové reakce“. Výzkum AIDS a lidské retroviry. 12 (17): 1605–13. doi:10.1089 / podpora.1996.12.1605. PMID  8947295.