Klenowův fragment - Klenow fragment

Funkční domény v Klenowově fragmentu (vlevo) a DNA polymerázy I (PDB).

The Klenowův fragment je velký protein fragment vytvořen, když DNA polymeráza I z E-coli je enzymaticky štěpený proteáza subtilisin. Poprvé hlášeno v roce 1970,[1] zachovává 5 '→ 3' polymeráza aktivita a 3 '→ 5' exonukleáza aktivita pro odstranění předkódujících nukleotidů a korektury, ale ztrácí svoji 5 '→ 3' exonukleázovou aktivitu.

Druhý menší fragment se vytvořil, když DNA polymeráza I z E-coli je štěpen subtilisinem, zachovává si 5 '→ 3' exonukleázovou aktivitu, ale nemá další dvě aktivity, které vykazuje Klenowův fragment (tj. 5 '→ 3' polymerázová aktivita a 3 '→ 5' exonukleázová aktivita).

Výzkum

Protože aktivita 5 '→ 3' exonukleázy DNA polymerázy I z E-coli dělá to nevhodným pro mnoho aplikací, Klenowův fragment, který tuto aktivitu postrádá, může být při výzkumu velmi užitečný. Klenowův fragment je mimořádně užitečný pro úkoly založené na výzkumu, jako jsou:

  • Syntéza dvouvláknové DNA z jednořetězcových templátů
  • Vyplňování ustupujících 3 'konců fragmentů DNA, aby byl 5' převis tupý
  • Trávení pryč vyčnívající 3 'převisy
  • Příprava radioaktivní DNA sondy

Klenowův fragment byl také původním enzymem používaným k velké amplifikaci segmentů DNA v DNA polymerázová řetězová reakce (PCR) proces,[2] před nahrazením termostabilními enzymy, jako je Taq polymeráza.[3]

Exo- Klenowův fragment

Stejně jako 5 '→ 3' exonukleáza činnost DNA polymeráza I z E-coli může být nežádoucí, 3 '→ 5' exonukleáza aktivita Klenowova fragmentu může být pro některé aplikace také nežádoucí. Tento problém lze překonat zavedením mutace v genu, který kóduje Klenowa. To má za následek, že jsou exprimovány formy enzymu, které si zachovávají 5 '→ 3' polymerázovou aktivitu, ale postrádají žádnou exonukleáza aktivita (5 '→ 3' nebo 3 '→ 5'). Tato forma enzymu se nazývá exo- Klenowův fragment.

Fragment exo-Klenow se používá v některých fluorescenčních značkovacích reakcích pro microarray a také v dA a dT tailing, důležitý krok v procesu ligace DNA adaptérů na fragmenty DNA, často používaný při přípravě DNA knihoven pro sekvenování další generace. (například viz [1] )

Reference

  1. ^ Klenow H a Henningsen I (1970). „Selektivní eliminace exonukleázové aktivity polymerázy deoxyribonukleové kyseliny z Escherichia coli B omezenou proteolýzou“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65 (1): 168–175. doi:10.1073 / pnas.65.1.168. PMC  286206. PMID  4905667.
  2. ^ Saiki RK a kol. (1985). „Enzymatická amplifikace genomových sekvencí β-globinu a analýza restrikčních míst pro diagnostiku srpkovité anémie“. Věda. 230: 1350–54. doi:10.1126 / science.2999980. PMID  2999980.
  3. ^ Saiki; et al. (1988). "Primerem řízená enzymatická amplifikace DNA termostabilní DNA polymerázou". Věda. 239: 487–91. doi:10.1126 / science.239.4839.487. PMID  2448875.

externí odkazy