Multiplexní polymerázová řetězová reakce - Multiplex polymerase chain reaction

Multiplexní polymerázová řetězová reakce (Multiplexní PCR) odkazuje na použití polymerázová řetězová reakce amplifikovat několik různých sekvencí DNA současně (jako by provádělo mnoho samostatných PCR reakcí společně v jedné reakci). Tento proces zesiluje DNA ve vzorcích pomocí více primery a teplotně zprostředkovaný DNA polymeráza v termální cyklovač. Návrh primerů pro všechny páry primerů musí být optimalizován tak, aby všechny páry primerů mohly během PCR pracovat při stejné teplotě nasedání.

Multiplex-PCR byla poprvé popsána v roce 1988 jako metoda detekce delecí v DNA dystrofin gen.[1] Rovněž byl použit s steroidní sulfatáza gen.[2] V roce 2008 byla pro analýzu DNA použita multiplexní PCR mikrosatelity a SNP.[3] V roce 2020 byly navrženy RT-PCR multiplexové testy, které kombinovaly více genových cílů z Centra pro nemoci a kontrolu v jedné reakci, aby se zvýšila dostupnost a propustnost molekulárního testování SARS-CoV-2 diagnostika. [4]

Multiplex-PCR se skládá z více sad primerů v jedné směsi PCR k produkci amplikony různých velikostí, které jsou specifické pro různé sekvence DNA. Cílením na více sekvencí najednou lze získat další informace z jediného zkušebního běhu, který by jinak vyžadoval několikanásobné reagencie a více času na provedení. Žíhací teploty pro každou ze sad primerů musí být optimalizovány tak, aby fungovaly správně v rámci jedné reakce, a velikosti amplikonů, tj. Jejich délka párů bází, by měly být dostatečně odlišné, aby se při vizualizaci Gelová elektroforéza. Alternativně, pokud se velikosti amplikonů překrývají, mohou být různé amplikony diferencovány a vizualizovány pomocí primerů, které byly obarveny různými barevnými fluorescenčními barvivy. K dispozici jsou komerční soupravy pro multiplexování pro PCR a používají je mnohé forenzní laboratoře k amplifikaci degradovaných vzorků DNA.

Aplikace

Některé z aplikace multiplexní PCR zahrnují:

  1. Identifikace patogenu[5]
  2. Vysoce výkonné genotypování SNP[6]
  3. Mutační analýza[7]
  4. Analýza genové delece[8]
  5. Kvantifikace šablony[9]
  6. Analýza propojení[10]
  7. Detekce RNA[11]
  8. Forenzní studia[12]
  9. Analýza stravy[13]

Reference

  1. ^ Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988). „Screening delece lokusu Duchenneovy svalové dystrofie pomocí amplifikace multiplexní DNA“. Výzkum nukleových kyselin. 16 (23): 11141–11156. doi:10.1093 / nar / 16.23.11141. PMC  339001. PMID  3205741.
  2. ^ Ballabio A, Ranier JE, Chamberlain JS, Zollo M, Caskey CT (1990). "Screening na delece genů steroidní sulfatázy (STS) multiplexní DNA amplifikací" (PDF). Genetika člověka. 84 (6): 571–573. doi:10.1007 / BF00210812. hdl:2027.42/47626. PMID  2338343.
  3. ^ Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ (2008). „Multiplex-ready PCR: nová metoda pro multiplexované genotypy SSR a SNP“. BMC Genomics. 9: 80. doi:10.1186/1471-2164-9-80. PMC  2275739. PMID  18282271.
  4. ^ Perchetti, GA; Nalla, AK; Huang, ML; Jerome, KR; Greninger, AL (2020). "Multiplexní sady primerů / sond pro detekci SARS-CoV-2 pomocí qRT-PCR". Journal of Clinical Virology. 129: 104499. doi:10.1016 / j.jcv.2020.104499. PMID  32535397.
  5. ^ Järvinen, Anna-Kaarina; Laakso, Sanna; Piiparinen, Pasi; Aittakorpi, Anne; Lindfors, Merja; Huopaniemi, Laura; Piiparinen, Heli; Mäki, Minna (2009). „Rychlá identifikace bakteriálních patogenů pomocí testu založeného na PCR a microarray“. Mikrobiologie BMC. 9: 161. doi:10.1186/1471-2180-9-161. PMC  2741468. PMID  19664269.
  6. ^ Myakishev, M. V. (2001). „High-Throughput SNP Genotyping by Allele-specific PCR with Universal Energy-Transfer-značené primery“. Výzkum genomu. 11 (1): 163–169. doi:10,1101 / gr. 157901. PMC  311033. PMID  11156625.
  7. ^ Morlan, John; Baker, Joffre; Sinicropi, Dominick (2009). „Detekce mutací pomocí PCR v reálném čase: jednoduchá, robustní a vysoce selektivní metoda“. PLOS ONE. 4 (2): e4584. Bibcode:2009PLoSO ... 4,4584 mil. doi:10,1371 / journal.pone.0004584. PMC  2642996. PMID  19240792.
  8. ^ Abbs, S; Bobrow, M (1992). „Analýza kvantitativní PCR pro diagnostiku delečních a duplikačních nosičů v genu pro dystrofin“. Journal of Medical Genetics. 29 (3): 191–196. doi:10,1136 / jmg.29.3.191. PMC  1015896. PMID  1552558.
  9. ^ „Vítejte | Zařízení pro profilování forenzní DNA“ (PDF).
  10. ^ Reis, Andre (1991). "PCR při analýze vazby genetických chorob". Témata PCR. 75–79. doi:10.1007/978-3-642-75924-6_15. ISBN  978-3-540-52934-7.
  11. ^ Miyakawa, Y .; Yoshizawa, H .; Mishiro, S .; Machida, A .; Akahane, Y .; Sugai, Y .; Tanaka, T .; Sugiyama, Y .; Okada, S .; Okamoto, H. (srpen 1990). „Detekce RNA viru hepatitidy C dvoustupňovou polymerázovou řetězovou reakcí se dvěma páry primerů odvozených z 5'-nekódující oblasti“. Japonský žurnál experimentální medicíny. 60 (4): 215–222. PMID  1963453.
  12. ^ „Důkaz DNA: základy analýzy“.
  13. ^ Dunshea, Glenn (2009). „Analýza stravy založená na DNA pro každého predátora“. PLOS ONE. 4 (4): e5252. Bibcode:2009PLoSO ... 4.5252D. doi:10,1371 / journal.pone.0005252. PMC  2668750. PMID  19390570.