Inverzní polymerázová řetězová reakce - Inverse polymerase chain reaction

Shrnutí procesu inverzní PCR.

Inverzní polymerázová řetězová reakce (Inverzní PCR) je variantou polymerázová řetězová reakce který se používá k zesílení DNA pouze s jednou známou sekvencí. Jedno omezení konvenční PCR je, že to vyžaduje primery komplementární k oběma konce cílové DNA, ale tato metoda umožňuje provádět PCR, i když je k dispozici pouze jedna sekvence, ze které mohou být navrženy primery.

Inverzní PCR je zvláště užitečná pro stanovení vložit umístění. Například různé retroviry a transpozice náhodně integrovat do genomová DNA.[1] K identifikaci míst, kam vstoupili, lze použít známé „interní“ virové nebo transpozonové sekvence k návrhu primerů, které budou amplifikovat malou část obklopující „vnější“ genomové DNA. Amplifikovaný produkt pak může být sekvenován a ve srovnání s databázemi DNA k vyhledání sekvence, která byla narušena.

Metoda inverzní PCR zahrnuje řadu omezení trávení a ligace, což má za následek smyčkový fragment, který může být připraven pro PCR z jediného úseku známé sekvence. Poté, stejně jako jiné procesy polymerázové řetězové reakce, je DNA amplifikována teplotně citlivou DNA polymeráza:

  1. Je identifikována cílová oblast s vnitřní částí známé sekvence a neznámými přilehlými oblastmi
  2. Genomická DNA je štěpena na několik fragmentů kilobáze obvykle nízkofrekvenčním (6-8 základním) řezáním restrikční enzym.
  3. Při nízkých koncentracích DNA je indukována vlastní ligace za vzniku produktu kruhové DNA.
  4. PCR se provádí jako obvykle s primery komplementárními k úsekům známé vnitřní sekvence. *

Nakonec je sekvence porovnána se sekvencí dostupnou v databázi a používá se v případě procházení chromozomů.

  • Poznámka: ačkoli obrázek naznačuje, že cirkulující ligační produkt je tráven před PCR, není tomu tak. PCR nevyžaduje lineární produkty a použití jiného restrikčního enzymu k štěpení známé sekvence by také mohlo štěpit v neznámé oblasti, což by mělo za následek selhání PCR.

Reference

  1. ^ Ochman, H .; Gerber, A. S .; Hartl, D. L. (01.01.1988). „Genetické aplikace inverzní polymerázové řetězové reakce“. Genetika. 120 (3): 621–623. ISSN  0016-6731. PMC  1203539. PMID  2852134.