Hot start PCR - Hot start PCR - Wikipedia

Hot start PCR je upravená forma konvenční polymerázová řetězová reakce (PCR), která snižuje přítomnost nežádoucích produktů a dimery primeru kvůli nespecifické amplifikaci DNA při pokojových (nebo chladnějších) teplotách.[1][2] Protože výsledky PCR jsou tak užitečné, bylo vyvinuto mnoho variací a modifikací postupu, aby se dosáhlo vyšších výtěžků, je jednou z nich PCR s horkým startem.[3] Hot start PCR se řídí stejnými principy jako konvenční PCR - v tom, že využívá DNA polymerázu k syntéze DNA z jednovláknového templátu,[4] využívá však další způsoby zahřívání a separace, jako je deaktivace nebo inhibice vazby Taq polymeráza a pozdní přidání Taq polymerázy, aby se zvýšil výtěžek produktu a poskytla vyšší specificita a citlivost.[5] Nespecifická vazba a primování nebo tvorba primerových dimerů jsou minimalizovány dokončením reakční směsi po denaturace[6] Některé způsoby, jak dokončit reakční směsi při vysokých teplotách, zahrnují modifikace, které blokují DNA polymeráza aktivita při nízkých teplotách,[1][7] použití modifikovaných deoxyribonukleotid trifosfátů (dNTP),[8] a fyzické přidání jednoho ze základních činidel po denaturaci.[9] Výsledky tohoto postupu mají mnoho aplikací jak z lékařského, tak průmyslového hlediska. Například aplikace PCR včetně forenzní analýzy, testování otcovství, biodefence, klonování, detekce mutací, genetické testování a sekvenování DNA.[10]

Prostřednictvím těchto dalších metod je PCR s horkým startem schopna snížit množství nespecifických amplifikací, které se přirozeně vyskytují při nižších teplotách - což pro konvenční PCR zůstává problémem. Tyto modifikace fungují celkově, aby zajistily, že specifické enzymy v roztoku zůstanou neaktivní nebo jsou inhibovány, dokud není dosaženo optimální teploty žíhání.[10] Inhibice tvorby nespecifických produktů PCR, zejména v počátečních cyklech, vede k podstatnému zvýšení citlivosti detekce pomocí PCR. To je nanejvýš důležité v diagnostických aplikacích PCR nebo RT-PCR.

Pozadí

Postup tradiční polymerázové řetězové reakce (PCR)

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je a molekulární biologie technika používaná k amplifikaci specifických segmentů DNA o několik řádů. Specifické segmenty DNA jsou amplifikovány třemi procesy, denaturací, žíháním a extenzí - kde jsou řetězce DNA odděleny zvýšením teploty na optimální teplotu od teploty místnosti, než se primery váží a polymeráza srovnává nukleotidy s templátovým vláknem. Využívá to DNA polymeráza, který je při nízkých teplotách mírně aktivní.[1] V konvenční PCR je reakční směs dokončena při teplotě místnosti a díky aktivitě DNA polymerázy se mohou tvořit primery dimery primeru nebo hybridizovat s DNA nespecificky. Během postupu PCR rozšíří DNA polymeráza jakýkoli kousek DNA o vázané primery, čímž vytvoří cílové produkty, ale také nespecifické produkty, které snižují výtěžek. U PCR s horkým startem některé z činidla se udržují odděleně, dokud se směs nezahřeje na specifickou teplotu žíhání. To snižuje dobu žíhání, což zase snižuje pravděpodobnost nespecifického prodloužení DNA a vliv nespecifické vazby primeru před denaturací.[6][5]

V konvenční PCR vede nižší teplota pod optimální teplotu nasedání (50-65 ° C) k modifikacím mimo cíl, jako jsou nespecifické amplifikace, kde se primery budou nespecificky vázat na nukleovou kyselinu.[5] Tyto nespecifické komplexy primerů, které jsou ve směsi v přebytku, jsou příčinou syntézy vedlejších produktů, jako je dimer primerů a nesprávná aktivace.[10] Mis-priming značně ztěžuje a snižuje účinnost PCR amplifikace aktivním soupeřením s cílovými sekvencemi o amplifikaci. Podobně dimery primerů tvoří komplexy, které snižují množství získaných amplifikací počtu kopií.[10] To lze řídit implementací PCR s horkým startem, která umožňuje blokovat rozšíření primeru, dokud nejsou splněny optimální teploty.[2]

V PCR s horkým startem jsou důležitá činidla (jako DNA polymeráza a hořčík) kofaktory ) je zabráněno v reakci ve směsi PCR, dokud není dosaženo optimální teploty fyzikální separací nebo chemickými úpravami.[5][2] Hot start PCR může také nastat, když je Taq polymeráza inhibována / inaktivována nebo je její přidání odloženo do dosažení optimálních teplot žíhání, prostřednictvím deoxyribonukleotid trifosfátových modifikací nebo modifikací primerů umístěním do klecí a sekundární struktura manipulace.

Hot start PCR je často lepší přístup oproti tradiční PCR za okolností, kdy je v reakční směsi nedostatek DNA (> 104 kopie), šablona DNA je velmi složitá nebo pokud existuje několik párů oligonukleotid primery v PCR.[3]

Metody

PCR vs. Hot start PCR: Kontrastní PCR s hot start PCR, zobrazením jejich metod a výsledného produktu PCR na gelu.

Hot start PCR je metoda, která zabraňuje prodloužení DNA polymerázy při nižší teplotě, aby se zabránilo nespecifické vazbě, aby se minimalizovala ztráta výtěžku. Hot start PCR snižuje množství nespecifické vazby prostřednictvím omezujících činidel až do zahřívacích kroků PCR - omezte reakci brzy omezením Taq DNA polymerázy v reakci. Nespecifická vazba často vede k dimerům primerů a cílům se špatně primovanými / falešně primovanými.[11] Ty lze opravit upravenými metodami, jako jsou:

Inaktivace / inhibice Taq DNA polymerázy

Protilátky spojené s enzymem / Taq DNA polymeráza v komplexu s anti Taq DNA polymerázovými protilátkami:

Protilátky spojené s enzymem inaktivují Taq DNA polymerázu. Protilátky se váží na polymerázu a váží se na ni, čímž zabraňují časné amplifikaci DNA, ke které může dojít při nižších teplotách. Jakmile je dosaženo optimální teploty žíhání, protilátky začnou degradovat a disociovat, uvolní Taq DNA polymerázu do reakce a umožní zahájení procesu amplifikace.[2][12] Platinová Taq DNA polymeráza a AccuStart Taq DNA polymeráza (oba vyvinuté Ayoubem Rashtchianem v Life technologies a Quanta BioSciences, v uvedeném pořadí) jsou příklady komerčně dostupných protilátek založených na Taq DNA polymerázách s horkým startem. Tyto Taq DNA polymerázy jsou prekomplexovány směsí monoklonálních protilátek specifických pro Taq DNA polymerázu.[13]

Voskové korálky:

Fyzikální bariéra je vytvořena mezi Taq DNA polymerázou a zbytkem složek PCR voskovými perličkami, které jsou závislé na teplotě. Jakmile teplota stoupne nad 70 ° C, během denaturačního kroku v prvním cyklu se vosková kulička roztaví, což umožní DNA polymeráze Taq uniknout přes bariéru a uvolnit se do reakce - zahájením procesu amplifikace. Vosková vrstva se poté během fáze zesílení přesune na vršek reakční směsi, aby později působila jako parozábrana.[2]

Vysoce specifické oligonukleotidy:

Oligonukleotidy jsou krátké polymery nukleové kyseliny, které se snadno váží. Vysoce specifické oligonukleotidy, jako jsou aptamery, se vážou na Taq DNA polymerázu při nižších teplotách a tím jsou ve směsi neaktivní. Pouze při vyšších teplotách se oligonukleotidy oddělí od Taq, což mu umožní reagovat.[5]

Jedná se o nejúčinnější metody pro PCR s horkým startem, obzvláště metody spojené s enzymem a vysoce specifické oligonukleotidy jsou nejvhodnější během postupů, které vyžadují kratší dobu inaktivace.[14] Je však známo, že jsou implementovány i jiné metody, jako například:

Pozdní přidání Taq DNA polymerázy

Předehřívání:

PCR zařízení se předem zahřívá, zatímco se složky míchají na ledu a poté se okamžitě umístí do PCR zařízení, jakmile dosáhne optimální teploty. To by eliminovalo požadovaný zahřívací proces, snížilo nespecifické žíhání primerů a zajistilo, že by byly odděleny případné párované primery ve směsi.[15]

Zmrazení:

Zmrazení působí jako forma fyzického oddělení podobně jako voskové perličky. Reakční směs obsahující primery, templátové vlákno, vodu a deoxyribonukleotid trifosfát (dNTP) se zmrazí před Taq polymerázou a zbývající komponenty PCR se přidají na zmrazenou směs. Tím se zabrání nespecifické vazbě.[15]

Pozdější přidání Taq:

Složky PCR v reakční směsi se připraví a zahřívají bez přidání Taq. Taq se do směsi přidá až poté, co se dosáhne optimální teploty. Tato metoda je však nejméně spolehlivá a může vést ke kontaminaci složek.[15]

Další metodou je PCR s horkým startem zprostředkovaná deoxyribonukleotid trifosfátem, která modifikuje nukleotidové báze prostřednictvím chránící skupiny.

Úpravy deoxyribonukleotid trifosfátu (dNTP)

Hot start dNTP může být chemicky upraven tak, aby zahrnoval tepelně citlivou chránící skupinu na 3 hlavním konci. Tato modifikace zabrání nukleotidům v interakci s Taq polymerázou k navázání na templátové vlákno, dokud nebude dosaženo optimálních teplot, proto bude ochranná skupina odstraněna během kroku aktivace teplem. Hot start dNTP, dA, dT, dC a dG nahrazují přirozené nukleotidy.[16][17] Doporučuje se použití všech čtyř modifikovaných nukleotidů, předchozí výzkumy však ukazují, že nahrazení jednoho nebo dvou přirozených nukleotidů modifikovanými dNTP by stačilo k zajištění, že nedojde k nespecifické amplifikaci.[16][17] Další chemická modifikace nukleové kyseliny je prostřednictvím tepelně reverzibilní kovalentní modifikace, která působí tak, že brání hybridizaci primerů se sledovaným templátem. Aminoskupina guanosinu interaguje s glyoxalem za vzniku dG.[18]

Upravené primery

Sekundární struktura:

Určitá sekundární struktura může bránit funkcím primerů. Například oligonukleotidy s vlásenkovou strukturou nemohou účinně působit jako primer. Po zahřátí reakční směsi na teplotu nasedání však primer projde změnou konformace, která místo toho umožní primeru vytvořit lineární strukturu, což umožní primeru připojit se k cílovému segmentu a zahájit PCR.[19][20]

Fotochemicky odnímatelné klece:

Do oligonukleotidového primeru je začleněna klecová skupina, což je chránící skupina, která je fotochemicky odstranitelná, jako jsou thymidinové fosforamidity v klecích. To umožňuje aktivaci a deaktivaci funkce primeru pomocí UV záření (365 nm). Proto lze primery aktivovat po dosažení teploty žíhání.[21]

Řízené přidávání hořčíku

Hořčík je vyžadován při PCR a působí jako kofaktor, protože Taq polymeráza je závislá na hořčíku.[22] Zvýšení koncentrace hořčíku a fosfátu ve standardních pufrových činidlech vytváří hořčík sraženina, poskytující horký start pro reakci, protože v průběhu fáze tepelného cyklování není pro DNA polymerázu žádný hořčík. Během tepelného cyklování se hořčík rozpustí zpět do roztoku a stane se dostupným pro použití polymerázy, což mu umožní normální fungování.[23]

Výhody

Hot start PCR je výhodný v tom, že vyžaduje méně manipulace a snižuje riziko kontaminace. Hot start PCR může být buď chemicky modifikovaná, nebo založená na protilátkách, což poskytuje postupu různé výhody. V chemicky modifikované PCR s horkým startem lze postup provést při pokojové teplotě a významně snižuje tvorbu primer-dimerů tím, že zabrání vzájemnému navázání primerů před zahájením procesu PCR, stejně jako omezení nespecifického primování. Podobně PCR s horkým startem inhibuje vazbu primerů na templátové sekvence, které mají nízkou homologii, což vede k chybným přípravám. Může také zlepšit specificitu a citlivost kvůli přísným podmínkám a také zvýšit výtěžek produktu cíleného fragmentu.[5] U PCR s horkým startem na bázi protilátek je polymeráza aktivována po počátečním denaturačním kroku během procesu cyklování, čímž se zkracuje požadovaná doba. To také vede k vysoké specifičnost.[14]

Omezení

Spolu se svými výhodami má hot start PCR také omezení, která je třeba vzít v úvahu před implementací metody. Hot start PCR vyžaduje přidání tepla po delší dobu na rozdíl od konvenční PCR, proto je templátová DNA náchylnější k poškození. Prodloužená doba zahřívání také znamená, že postup není kompatibilní s určitými postupy, jako je metoda reverzní transkripce s jednou pufrem s jednou pufrem, která vyžaduje nižší teplotu, aby podstoupila krok reverzní transkripce.[12] V chemicky modifikované PCR s horkým startem může být proces amplifikace DNA negativně ovlivněn jednak kvůli významnému prodloužení doby reaktivace potřebné pro aktivaci polymerázy a jednak pokud je délka templátu cílové DNA příliš dlouhá.[14] V postupech založených na protilátkách vyžaduje každý enzym jinou protilátku, a proto jsou náklady na provedení postupu vyšší[15]

Reference

  1. ^ A b C Sharkey DJ, Scalice ER, Christy KG, Atwood SM, Daiss JL (květen 1994). „Protilátky jako termolabilní spínače: spouštění při vysoké teplotě pro polymerázovou řetězovou reakci“. Bio / technologie. 12 (5): 506–9. doi:10.1038 / nbt0594-506. PMID  7764710. S2CID  2885453.
  2. ^ A b C d E Paul N, Shum J, Le T (2010). "Hot start PCR". Protokoly RT-PCR. Metody v molekulární biologii. 630. Humana Press. 301–18. doi:10.1007/978-1-60761-629-0_19. ISBN  9781607616283. PMID  20301005.
  3. ^ A b Green, Michael R .; Sambrook, Joseph (květen 2018). "Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)". Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (5): pdb.prot095125. doi:10.1101 / pdb.prot095125. ISSN  1940-3402. PMID  29717052.
  4. ^ Aryal, Sagar (2015-04-23). „Polymerázová řetězová reakce (PCR) - princip, postup, typy, aplikace a animace“. Mikrobiologie Info.com. Citováno 2020-05-29.
  5. ^ A b C d E F Birch DE (květen 1996). Msgstr "Zjednodušená hot start PCR". Příroda. 381 (6581): 445–6. Bibcode:1996 Natur.381..445B. doi:10.1038 / 381445a0. PMID  8632804. S2CID  4267296.
  6. ^ A b van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP, eds. (2008). "Varianty a úpravy standardního protokolu PCR". Principy a technické aspekty amplifikace PCR. Springer Nizozemsko. 231–276. doi:10.1007/978-1-4020-6241-4_12. ISBN  9781402062414.
  7. ^ „Jak je technologie Hot-Start výhodná pro vaši PCR?“. Thermofisher. Citováno 2019-10-03.
  8. ^ „DNTP - The School of Biomedical Sciences Wiki“. výuka.ncl.ac.uk. Citováno 2019-10-09.
  9. ^ Coleman WB (2016). Diagnostická molekulární patologie. [Londýn]: Elsevier Academic Press. ISBN  9780128011577. OCLC  960448665.
  10. ^ A b C d Lebedev, Alexandre V .; Paul, Nataša; Yee, Joyclyn; Timoshchuk, Victor A .; Shum, Jonathan; Miyagi, Kei; Kellum, Jack; Hogrefe, Richard I .; Zon, Gerald (listopad 2008). „Hot Start PCR s tepelně aktivovatelnými primery: nový přístup pro lepší výkon PCR“. Výzkum nukleových kyselin. 36 (20): e131. doi:10.1093 / nar / gkn575. ISSN  1362-4962. PMC  2582603. PMID  18796527.
  11. ^ Kermekchiev, Milko B .; Tzekov, Anatoly; Barnes, Wayne M. (01.11.2003). „Mutanty Taq DNA polymerázy citlivé na chlad poskytují horký start pro PCR“. Výzkum nukleových kyselin. 31 (21): 6139–6147. doi:10.1093 / nar / gkg 813. ISSN  0305-1048. PMC  275455. PMID  14576300.
  12. ^ A b Schoenbrunner, Nancy J; Gupta, Amar P; Young, Karen K Y; Will, Stephen G (01.01.2017). „Kovalentní modifikace primerů zlepšuje specificitu a výtěžek amplifikace PCR“. Biologické metody a protokoly. 2 (1): bpx011. doi:10.1093 / biometody / bpx011. ISSN  2396-8923. PMC  6994073. PMID  32161793.
  13. ^ Westfall et.al. (1997), Focus 19.3, strana 46.
  14. ^ A b C „Jak je technologie Hot-Start přínosná pro vaši PCR - AU“. www.thermofisher.com. Citováno 2020-05-29.
  15. ^ A b C d „Co je to hot start PCR?“. Genetická výchova. 2019-03-03. Citováno 2020-05-29.
  16. ^ A b Koukhareva, Inna; Lebedev, Alexandre (2009-06-15). „3′-Chráněný 2′-deoxynukleosid 5′-trifosfáty jako nástroj pro tepelnou aktivaci polymerázové řetězové reakce“. Analytická chemie. 81 (12): 4955–4962. doi:10.1021 / ac8026977. ISSN  0003-2700. PMC  2712722. PMID  19438248.
  17. ^ A b Koukhareva, I .; Haoqiang, H .; Yee, J .; Shum, J .; Paul, N .; Hogrefe, R. I .; Lebedev, A. V. (2008-09-01). „Tepelně aktivovatelné 3'-modifikované dNTP: Syntéza a aplikace pro Hot Start PCR“. Série sympozií o nukleových kyselinách. 52 (1): 259–260. doi:10.1093 / nass / nrn131. ISSN  0261-3166. PMID  18776352.
  18. ^ [1] „Reverzibilní chemická modifikace nukleových kyselin a vylepšená metoda hybridizace nukleových kyselin“, vydaná 10. 10. 2002 
  19. ^ Ailenberg, M a Silverman, M, 2000-11-1, Řízený horký start a zlepšená specificita při provádění PCR s využitím primerů pro retušování a smyčku (TULIPS), Biotechniques, 29 (5): 1018-1022, doi: 10,2144 / 00295st03, PMID: 11084864
  20. ^ Kaboev, O. K .; Luchkina, L. A .; Tret'iakov, A. N .; Bahrmand, A. R. (2000-11-01). "PCR horký start s použitím primerů se strukturou molekulárních majáků (vlásenková struktura)". Výzkum nukleových kyselin. 28 (21): e94. doi:10.1093 / nar / 28.21.e94. ISSN  0305-1048. PMC  113163. PMID  11058144.
  21. ^ Young, Douglas D .; Edwards, Wesleigh F .; Lusic, Hrvoje; Živě, Mark O .; Deiters, Alexander (10.01.2008). „Světelná polymerázová řetězová reakce“. Chemická komunikace (4): 462–464. doi:10.1039 / B715152G. ISSN  1364-548X. PMC  3760149. PMID  18188468.
  22. ^ Markoulatos, P .; Siafakas, N .; Moncany, M. (2002). „Multiplexní polymerázová řetězová reakce: praktický přístup“. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 16 (1): 47–51. doi:10.1002 / jcla.2058. ISSN  0887-8013. PMC  6808141. PMID  11835531.
  23. ^ Barnes, Wayne M; Rowlyk, Katherine R (červen 2002). Msgstr "Metoda horkého startu sraženiny hořčíku pro PCR". Molekulární a buněčné sondy. 16 (3): 167–171. doi:10,1006 / mcpr.2002.0407. PMID  12219733.