Cirkulující nádorová DNA - Circulating tumor DNA

Cirkulující nádorová DNA (ctDNA) se nachází v sérum a plazma zlomky z krev. Mechanismus uvolňování ctDNA však není znám apoptóza, nekróza a byla předpokládána aktivní sekrece z nádorových buněk. Jakmile je ctDNA izolována, může být sekvenována pro mutační analýzu.

Cirkulující nádorová DNA (ctDNA) je nádor - odvozeno roztříštěno DNA v krevním řečišti, který není spojen s buňkami. ctDNA by neměla být zaměňována s bezbuněčnou DNA (cfDNA), což je širší pojem, který popisuje DNA, která volně cirkuluje v krevním řečišti, ale nemusí nutně pocházet z nádoru. Protože ctDNA může odrážet celý nádor genom, získala trakci pro svou potenciální klinickou užitečnost; "tekuté biopsie „Ve formě odběrů krve lze odebírat v různých časových bodech k monitorování progrese nádoru během léčebného režimu.[1]

ctDNA pochází přímo z nádoru nebo z cirkulující nádorové buňky (CTC),[2] který popisuje životaschopné intaktní nádorové buňky, které se vylučují z primárních nádorů a vstupují do krevního řečiště nebo lymfatický Systém. Přesný mechanismus uvolňování ctDNA je nejasný. Mezi biologické procesy předpokládané, že se účastní uvolňování ctDNA, patří apoptóza a nekróza z umírajících buněk nebo aktivního uvolňování ze životaschopných nádorových buněk.[3][4][5][6][7] Studie u lidí (zdravých i pacientů s rakovinou)[8] a xenograftované myši[9] ukazují, že velikost fragmentované cfDNA je převážně 166 bp dlouhá, což odpovídá délce DNA omotané kolem nukleosom plus linker. Fragmentace této délky může svědčit o apoptotická fragmentace DNA, což naznačuje, že apoptóza může být primární metodou uvolňování ctDNA. Fragmentace cfDNA se mění v plazmě pacientů s rakovinou.[10][11]

Ve zdravé tkáni, infiltrující fagocyty jsou zodpovědné za odstraňování apoptotických nebo nekrotických buněčných zbytků, které zahrnují cfDNA.[12] Hladiny cfDNA u zdravých pacientů jsou přítomny pouze v nízkých hladinách, ale u pacientů s rakovinou lze detekovat vyšší hladiny ctDNA. K tomu pravděpodobně dochází v důsledku neúčinné infiltrace imunitních buněk do míst nádoru, což snižuje účinnou clearance ctDNA z krevního řečiště.[12] Porovnání mutací v ctDNA a DNA extrahovaných z primárních nádorů stejných pacientů odhalilo přítomnost identických geneticky významných změn souvisejících s rakovinou. [13][14] To vedlo k možnosti použití ctDNA pro dřívější detekci rakoviny a následné sledování léčby. [15]


Metody

Preanalytické úvahy

Když je krev shromažďována v EDTA zkumavkách a skladována, bílé krvinky začnou lyžovat a uvolňovat genomovou DNA divokého typu do vzorku v množství typicky mnohonásobně vyšším, než je přítomna ctDNA.[16] To ztěžuje detekci mutací nebo jiných biomarkerů ctDNA.[17] Použití komerčně dostupných zkumavek pro stabilizaci buněk může zabránit nebo oddálit lýzu bílých krvinek, čímž se sníží ředicí účinek ctDNA.[18] Sherwood et al prokázali vynikající detekci KRAS mutace v uzavřených vzorcích shromážděných jak ve zkumavkách EDTA K3, tak ve Streck BCT.[18] Výhody trubic pro stabilizaci buněk lze realizovat v situaci, kdy krev nelze okamžitě zpracovat na plazmu.

Jiné postupy mohou také snížit množství „kontaminující“ DNA divokého typu a učinit detekci ctDNA proveditelnější:[18]

  • Před extrakcí plazmy pro analýzu ctDNA nikdy nezmrazujte vzorek krve
  • Zpracujte vzorek do plazmy během 2–4 hodin (pokud je odebrán do zkumavky EDTA)
  • Nikdy nepoužívejte heparinizované zkumavky, heparin inhibuje PCR napodobováním spirálovité struktury DNA
  • Proveďte krok dvojité centrifugace (centrifugujte krev, abyste odstranili plazmu, poté opakujte na plazmě, abyste odstranili zbytky ve spodní části zkumavky), abyste odstranili více buněčných zbytků před extrakcí DNA.
  • Plazma je pro obnovení ctDNA lepší než sérum[19]

Extrakce ctDNA

Hlavní přitažlivost analýzy ctDNA spočívá v tom, že je extrahována neinvazivním způsobem prostřednictvím odběru krve. Získání cfDNA nebo ctDNA obvykle vyžaduje odebrání přibližně 3 ml krve do EDTA - potažené trubky. Užívání EDTA je důležité ke snížení srážlivosti krve. The plazma a sérum frakce krve lze oddělit centrifugací. Z těchto frakcí lze následně extrahovat ctDNA nebo cfDNA. Ačkoli sérum má tendenci mít vyšší hladiny cfDNA, je to primárně připisováno DNA z lymfocytů.[20] Vysoká úroveň kontaminace cfDNA je neoptimální, protože to může snížit citlivost detekce ctDNA. Proto většina studií používá k izolaci ctDNA plazmu. Plazma se poté znovu zpracuje odstředěním, aby se odstranily zbytkové neporušené krvinky. Supernatant se používá pro extrakci DNA, kterou lze provést pomocí komerčně dostupných souprav.

Analýza ctDNA

Analýza ctDNA po extrakci vyžaduje použití různých metod amplifikace a sekvenování. Tyto metody lze rozdělit do dvou hlavních skupin na základě toho, zda je cílem vyslýchat všechny geny v necíleném přístupu, nebo zda je cílem sledovat specifické geny a mutace v cíleném přístupu.

Necílené přístupy

K objevení nových mutací v nádorové DNA při sledování zátěže nemocí nebo sledování rezistence na léky může být nezbytný přístup k sekvenování celého genomu nebo celého exomu.[21] Necílené přístupy jsou také užitečné ve výzkumu ke sledování heterogenity nádorů nebo k objevování nových lékových cílů. Přestože v určitých aplikacích mohou být nezbytné necílené metody, je to dražší a má nižší rozlišení. To ztěžuje detekci vzácných mutací nebo v situacích, kdy jsou přítomny nízké hladiny ctDNA (například minimální reziduální onemocnění). Dále mohou nastat problémy s rozlišením mezi DNA z nádorových buněk a DNA z normálních buněk s využitím přístupu celého genomu.

Obvykle se používá sekvenování celého genomu nebo exomu vysoce výkonné technologie sekvenování DNA. Omezení sekvenování pouze na celý exome místo toho může snížit náklady a zvýšit rychlost, ale za cenu ztráty informací o mutacích v nekódujících regulačních oblastech DNA.[22] Zatímco pouhý pohled na polymorfismy DNA sekvenováním nerozlišuje DNA od nádorových nebo normálních buněk, lze tento problém vyřešit porovnáním s kontrolním vzorkem normální DNA (například DNA získaná pomocí bukální výtěr Důležité: Pro objevení počáteční mutace je užitečné sekvenování celého genomu a celého exomu. To poskytuje informace pro použití citlivějších cílených technik, které lze poté použít pro účely sledování nemocí.

Sekvenování celého genomu umožňuje obnovit strukturní vlastnosti cfDNA, velikost fragmentů a jejich fragmentační vzorce. Tyto jedinečné vzory mohou být důležitým zdrojem informací ke zlepšení detekce ctDNA nebo k lokalizaci tkáně původu těchto fragmentů.[23] Výběr velikosti krátkých fragmentů (<150 bp) metodami in vitro nebo in silico by mohl zlepšit regeneraci mutací a aberace počtu kopií.[24]

Digitální karyotypizace

Tato metoda byla původně vyvinuta laboratoří Bert Vogelstein, Luis Diaz a Victor Velculescu na Univerzita Johna Hopkinse.[25] Na rozdíl od normálu karyotypizace pokud se barvivo používá k barvení chromozomálních pásů za účelem vizualizace chromozomů, digitální karyotypizace používá sekvence DNA lokusů v celém genomu k výpočtu variace počtu kopií.[25] Varianty počtu kopií jsou u rakovin běžné a popisují situace, kdy ztráta heterozygotnosti genu může vést ke snížení funkce v důsledku nižší exprese nebo duplikaci genu, což vede k nadměrné expresi.

Personalizovaná analýza přeskupených konců (PARE)

Poté, co je celý genom sekvenován pomocí vysoce výkonné metody sekvenování, jako je Illumina HiSeq, je na data použita PARE k analýze chromozomálních přeskupení a translokací. Tato technika byla původně navržena pro analýzu DNA solidního nádoru, ale byla upravena pro aplikace ctDNA.[25]

Methylace DNA a hydroxymethylace

Správně epigenetický značení je nezbytné pro normální genovou expresi a funkci buněk a aberantní změny v epigenetických vzorcích jsou charakteristickým znakem rakoviny.[26] Normální epigenetický stav je v buňce udržován alespoň částečně Methylace DNA.[27] Měření aberantních methylačních vzorců v ctDNA je možné díky stabilní methylaci oblastí DNA označovaných jako „CpG ostrovy “. Methylaci ctDNA lze detekovat prostřednictvím hydrogensiřičitanová úprava. Zpracování hydrogensiřičitanem chemicky převádí nemetylované cytosiny na uracil, přičemž methylované cytosiny zůstává beze změny. DNA je následně sekvenována a lze identifikovat jakékoli změny ve vzorci methylace DNA. Hydroxymethylace DNA je podobně asociovaná značka, která se ukázala jako prediktivní marker zdravých a nemocných stavů v cfDNA, včetně rakoviny. Měření aberantních hydroxymethylačních vzorců v ctDNA bylo prokázáno vědci z University of Chicago (laboratoř Chuan He,[28]) Stanfordská univerzita (Quake lab,[29]) a společnost Cambridge Epigenetix.

Cílené přístupy

V cíleném přístupu může být sekvenování ctDNA zaměřeno na genetický panel konstruovaný na základě mutačních hotspotů pro sledovanou rakovinu. To je zvláště důležité pro informování léčby v situacích, kdy jsou mutace identifikovány v drogových cílech.[22] Personalizovaná cílená analýza ctDNA pro každého pacienta je také možná kombinací tekutých biopsií se standardními primárními biopsiemi tkání. Sekvenování biopsie primárního nádoru z celého genomu nebo celého exomu umožňuje objev genetických mutací specifických pro nádor pacienta a lze jej použít pro následné cílené sekvenování ctDNA pacienta. Nejvyšší citlivosti detekce ctDNA je dosaženo cíleným sekvenováním specifických jednonukleotidové polymorfismy (SNP). Běžně mutované geny, jako jsou onkogeny, které mají obvykle hotspotové mutace, jsou dobrými kandidáty na přístupy cílené sekvenování. Naopak, většina tumor supresorových genů má širokou škálu možných ztrát funkčních mutací v celém genu, a jako takové nejsou vhodné pro cílené sekvenování.

Cílené přístupy mají tu výhodu, že zesilují ctDNA prostřednictvím polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo digitální PCR. To je zvláště důležité při analýze ctDNA nejen proto, že v krvi cirkuluje relativně nízká hladina DNA, ale také proto, že ctDNA tvoří malý podíl z celkové extrahované DNA bez buněk.[22] Proto může amplifikace zájmových oblastí drasticky zlepšit citlivost detekce ctDNA. Avšak amplifikace pomocí PCR může způsobit chyby vzhledem k inherentní chybovosti DNA polymeráz. Chyby zavedené během sekvenování mohou také snížit citlivost detekce mutací ctDNA.

Droplet Digital PCR (ddPCR)

Tato metoda je odvozena z digitální PCR, původně pojmenované Bert Vogelstein Je skupina v Univerzita Johna Hopkinse. Droplet Digital PCR využívá generátor kapiček k rozdělení jednotlivých kousků DNA na kapičky pomocí emulze olej / voda. Pak v každé kapičce dochází k jednotlivým polymerázovým řetězovým reakcím za použití vybraných primerů proti oblastem ctDNA a pokračuje ke koncovému bodu. Přítomnost sledovaných sekvencí se měří fluorescenčními sondami, které se vážou na amplifikovanou oblast. ddPCR umožňuje vysoce kvantitativní hodnocení frekvencí alel a mutantů v ctDNA, ale je omezen počtem fluorescenčních sond, které lze použít v jednom testu (až 5).[30] Citlivost testu se může lišit v závislosti na množství analyzované DNA a pohybuje se kolem 1 z 10 000.[30]

Korálky, emulgace, zesílení a magnetické pole (BEAMing )

Tato technika staví na Droplet Digital PCR za účelem identifikace mutací v ctDNA pomocí průtokové cytometrie.[31] Po extrakci ctDNA z krve se provede PCR s primery navrženými k cílení na oblasti zájmu. Tyto primery také obsahují specifické sekvence DNA nebo značky. Amplifikovaná DNA se smísí s magnetickými kuličkami potaženými streptavidinem a emulguje se na kapičky. Biotinylované primery určené k vazbě na značky se používají k amplifikaci DNA. Biotinylace umožňuje amplifikované DNA vázat se na magnetické kuličky, které jsou potaženy streptavidinem. Po dokončení PCR se kuličky navázané na DNA oddělí pomocí magnetu. DNA na kuličkách se poté denaturuje a nechá se hybridizovat s fluorescenčními oligonukleotidy specifickými pro každou templát DNA. Výsledné komplexy kulička-DNA se poté analyzují pomocí průtokové cytometrie. Tato technika je schopna zachytit alelové a mutační frekvence v důsledku vazby s ddPCR. Na rozdíl od ddPCR však může být vyslýchán větší počet sekvencí DNA kvůli flexibilitě použití fluorescenčně vázaných sond. Další výhodou tohoto systému je, že izolovaná DNA může být také použita pro následné sekvenování.[32] Citlivost je 1,6 z 10 000 až 4,3 ze 100 000.[30]

CAncer Personalizované profilování hlubokým sekvenováním (CAPP-Seq)

Tuto metodu původně popsal Ash Alizadeh a skupiny Maximiliána Diehna v Stanfordská Univerzita. Tato technika používá biotinylované oligonukleotidové selektorové sondy k cílovým sekvencím DNA relevantní pro detekci ctDNA.[33] Veřejně dostupné databáze rakoviny byly použity ke konstrukci knihovny sond proti rekurentním mutacím v rakovině výpočtem jejich indexu rekurence. Protokol byl optimalizován pro nízké hladiny DNA pozorované při sběru ctDNA. Pak izolovaná DNA prochází hlubokým sekvenováním pro zvýšení citlivosti. Tato technika umožňuje vyslýchání stovek oblastí DNA. Citlivost detekce ctDNA CAPP-Seq se uvádí jako 2,5 molekuly z 1 000 000.[34]

Označeno AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq)

TAM-Seq umožňuje cílené sekvenování celých genů k detekci mutací v ctDNA.[35] Nejprve se provede obecný krok amplifikace s použitím primerů, které pokrývají celý požadovaný gen v 150-200bp sekcích. Poté se k připojení adaptérů s jedinečným identifikátorem ke každému amplikonu použije mikrofluidický systém, který dále amplifikuje DNA v paralelních jednoplexních reakcích. Ukázalo se, že tato technika úspěšně identifikuje mutace rozptýlené v supresorovém genu TP53 u pacientek s pokročilým karcinomem vaječníků. Citlivost této techniky je 1 ku 50.

Bezpečné sekvenování (Safe-Seq)

Tuto metodu původně popsal Bert Vogelstein a jeho skupina v Univerzita Johna Hopkinse. Safe-Seq snižuje chybovost masivně paralelního sekvenování, aby se zvýšila citlivost na vzácné mutanty.[36] Dosahuje toho přidáním sekvence jedinečného identifikátoru (UID) do každé šablony DNA. DNA je poté amplifikována pomocí přidaných UID a sekvenována. Všechny molekuly DNA se stejným UID (rodina UID) by měly mít stejnou hlášenou sekvenci DNA, protože byly amplifikovány z jedné molekuly. Mutace však mohou být zavedeny amplifikací nebo mohou být v krocích sekvenování a analýzy vyvolána nesprávná přiřazení báze. Přítomnost UID umožňuje oddělit tyto chyby metodiky od skutečných mutací ctDNA. Mutace je považována za „supermutanta“, pokud je 95% sekvenovaných čtení shodných. Citlivost tohoto přístupu je 9 ku 1 milionu.[30]

Duplexní řazení

Tato metoda je vylepšením jednotlivých UID přidaných do techniky Safe-Seq.[37] V duplexním sekvenování působí randomizovaná dvouvláknová DNA jako jedinečné značky a je připojena k invariantnímu spaceru. Značky jsou připojeny k oběma koncům fragmentu DNA (tagy α a β), což vede ke dvěma jedinečným templátům pro PCR - jeden řetězec s tagem α na 5 'konci a tag β na 3' konci a druhý řetězec se značkou β na 5 'konci a značkou α na 3' konci. Tyto fragmenty DNA se poté amplifikují primery proti invariantním sekvencím značek. Amplifikovaná DNA je sekvenována a analyzována. DNA s duplexními adaptéry jsou porovnány a mutace jsou akceptovány pouze v případě, že existuje shoda mezi oběma řetězci. Tato metoda bere v úvahu jak chyby ze sekvenování, tak chyby z časné fáze amplifikace PCR. Citlivost přístupu k objevování mutantů je 1 ku 10 ^ 7.

Integrované potlačení digitálních chyb (iDES) vylepšené CAPP sekv

iDES zlepšuje CAPP-Seq analýzu ctDNA za účelem snížení chyby a tím i zvýšení citlivosti detekce.[34] Společnost iDES, která byla uvedena v roce 2016, kombinuje CAPP-Seq s technologií duplexního čárového kódování a s výpočetním algoritmem, který odstraňuje stereotypní chyby spojené s krokem hybridizace CAPP-Seq. Metoda také integruje duplexní sekvenování, kde je to možné, a zahrnuje metody pro účinnější duplexní zotavení z bezbuněčné DNA. Citlivost této vylepšené verze CAPP-Seq je 4 na 100 000 kopií.

Úvahy

„Normální“ vs. detekce nádorové DNA

Jednou z výzev při používání ctDNA jako biomarkeru rakoviny je, zda lze ctDNA odlišit od cfDNA od normálních buněk. cfDNA se uvolňuje nezhoubnými buňkami během normálního buněčného obratu, ale také během postupů, jako je chirurgická operace, radioterapie nebo chemoterapie. Předpokládá se, že leukocyty jsou primárními přispěvateli k cfDNA v séru.[22]

Výzkum

ctDNA při screeningu rakoviny

Klinická užitečnost ctDNA pro detekci primárního onemocnění je částečně omezena citlivostí současné technologie; jsou přítomny nízké hladiny ctDNA a mutace ovladače nejsou známy.[30]

ctDNA v monitorování rakoviny

Důkaz onemocnění tradičními zobrazovacími metodami, jako je např CT, PET nebo MRI může po resekci nádoru chybět. Analýza ctDNA proto představuje potenciální cestu k detekci minimální reziduální nemoc (MRD), a tedy možnost recidivy tumoru v případech, kdy objemný tumor chybí konvenčními zobrazovacími metodami. Srovnání detekce MRD pomocí CT zobrazování ve srovnání s ctDNA bylo dříve provedeno u jedinců s rakovinou tlustého střeva ve stadiu II; v této studii byli vědci schopni detekovat ctDNA u jedinců, kteří nevykazovali žádné známky klinické malignity pomocí CT, což naznačuje, že detekce ctDNA má větší citlivost k hodnocení MRD.[22] Autoři však uznávají, že analýza ctDNA není bez omezení; vzorky plazmy odebrané po operaci byly schopny předpovědět recidivu po 36 měsících pouze ve 48% případů.[22]

ctDNA jako prognostický biomarker

Otázka, zda měření množství nebo vlastností ctDNA může být použito ke stanovení výsledků u lidí s rakovinou, byla předmětem studia. Od roku 2015 to bylo velmi nejisté.[38] Přestože některé studie ukázaly trend vyšších hladin ctDNA u lidí s vysokým stadiem metastazujícího karcinomu, zátěž ctDNA nekoreluje vždy s tradičním stagingem rakoviny.[30] Od roku 2017 se zdálo nepravděpodobné, že by ctDNA byla klinicky užitečná jako jediný prediktor prognózy.[39]

Výzkum rakoviny

Výskyt nádorů rezistentních na léčiva v důsledku intra- a inter-tumorové heterogenity je problémem v účinnosti léčby. Menší genetický klon v nádoru se může po léčbě rozšířit, pokud nese mutaci rezistentní na léčivo. Počáteční biopsie mohou tyto klony vynechat kvůli nízké frekvenci nebo prostorové separaci buněk v nádoru. Například protože biopsie vzorkuje pouze malou část nádoru, mohou být klony, které se nacházejí na jiném místě, bez povšimnutí. To může uvést v omyl výzkum, který se zaměřuje na studium role heterogenity nádorů v progresi a relapsu rakoviny. Použití ctDNA ve výzkumu může zmírnit tyto obavy, protože by mohlo poskytnout reprezentativnější „screenshot“ genetické rozmanitosti rakoviny v primárních i metastatických místech. Ukázalo se například, že ctDNA je užitečná při studiu klonálního vývoje rakoviny pacienta před a po léčbě.[40] Včasná detekce rakoviny je stále náročná, ale nedávný pokrok v analýze epigenetických vlastností cfDNA nebo odemknutí fragmentační struktury zlepšuje citlivost kapalné biopsie.[41]

Výzvy k provádění

Implementaci ctDNA v klinické praxi z velké části brání nedostatek standardizovaných metod pro zpracování a analýzu ctDNA. Než se analýza ctDNA může stát rutinním klinickým testem, musí být stanovena standardizace metod pro odběr vzorků (včetně doby odběru), následného zpracování (extrakce a amplifikace DNA), kvantifikace a validace. Kromě toho může být nutné vytvořit panel „standardních“ biomarkerů asociovaných s nádory vzhledem k rozlišení současných metod sekvenování a detekce ctDNA. Sekvenování nádorových specifických aberací ze vzorků plazmy může také pomoci vyloučit z analýzy kontaminující cfDNA; zvýšené hladiny cfDNA z normálních buněk lze připsat příčinám nesouvisejícím s rakovinou.[22]

Viz také

Reference

  1. ^ Wan J, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton J, Caldas C, Pacey S, Baird R, Rosenfeld N (duben 2017). „Tekuté biopsie dospívají: k implementaci cirkulující nádorové DNA“. Nature Reviews Cancer. 17 (4): 223–238. doi:10.1038 / nrc.2017.7. PMID  28233803. S2CID  4561229.
  2. ^ Akca H, Demiray A, Yaren A, Bir F, Koseler A, Iwakawa R, Bagci G, Yokota J (březen 2013). „Využití sérové ​​DNA a pyrosekvenování pro detekci mutací EGFR u nemalobuněčného karcinomu plic“. Genetika rakoviny. 206 (3): 73–80. doi:10.1016 / j.cancergen.2013.01.005. PMID  23491080.
  3. ^ Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K (červen 2011). „Bezbuněčné nukleové kyseliny jako biomarkery u pacientů s rakovinou“. Recenze přírody. Rakovina. 11 (6): 426–37. doi:10.1038 / nrc3066. PMID  21562580. S2CID  6061607.
  4. ^ Stroun M, Anker P (červenec 1972). „Nukleové kyseliny spontánně uvolňované živými žabími ušima“. The Biochemical Journal. 128 (3): 100P – 101P. doi:10.1042 / bj1280100pb. PMC  1173871. PMID  4634816.
  5. ^ Stroun M, Lyautey J, Lederrey C, Olson-Sand A, Anker P (listopad 2001). „O možném původu a mechanismu cirkulující apoptózy DNA a aktivním uvolňování DNA“. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 313 (1–2): 139–42. doi:10.1016 / S0009-8981 (01) 00665-9. PMID  11694251.
  6. ^ Anker P, Stroun M, Maurice PA (září 1975). „Spontánní uvolnění DNA lidskými krevními lymfocyty, jak je ukázáno v systému in vitro“. Výzkum rakoviny. 35 (9): 2375–82. PMID  1149042.
  7. ^ Rogers JC, Boldt D, Kornfeld S, Skinner A, Valeri CR (červenec 1972). „Vylučování deoxyribonukleové kyseliny lymfocyty stimulovanými fytohemaglutininem nebo antigenem“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 69 (7): 1685–9. Bibcode:1972PNAS ... 69.1685R. doi:10.1073 / pnas.69.7.1685. PMC  426778. PMID  4505646.
  8. ^ Heitzer E, Auer M, Hoffmann EM, Pichler M, Gasch C, Ulz P, Lax S, Waldispuehl-Geigl J, Mauermann O, Mohan S, Pristauz G, Lackner C, Höfler G, Eisner F, Petru E, Sill H, Samonigg H, Pantel K, Riethdorf S, Bauernhofer T, Geigl JB, Speicher MR (červenec 2013). „Stanovení změn počtu kopií specifických pro nádor z plazmatické DNA pacientů s rakovinou“. International Journal of Cancer. 133 (2): 346–56. doi:10.1002 / ijc.28030. PMC  3708119. PMID  23319339.
  9. ^ Thierry AR, Mouliere F, Gongora C, Ollier J, Robert B, Ychou M, Del Rio M, Molina F (říjen 2010). "Původ a kvantifikace cirkulující DNA u myší s lidskými xenoimplantáty kolorektálního karcinomu". Výzkum nukleových kyselin. 38 (18): 6159–75. doi:10.1093 / nar / gkq421. PMC  2952865. PMID  20494973.
  10. ^ Mouliere F, Robert B, Arnau Peyrotte E, Del Rio M, Ychou M a kol. (2011) Vysoká fragmentace charakterizuje cirkulující DNA odvozenou z nádoru. PLOS ONE 6 (9): e23418. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023418
  11. ^ Mouliere F, Chandrananda D, Piskorz AM, Moore EK, Morris J, Ahlborn LB, Mair R, Goranova T, Marass F, Heider K, Wan JCM, Supernat A, Hudecova I, Gounaris I, Ros S, Jimenez-Linan M, Garcia-Corbacho J, Patel K, Østrup O, Murphy S, Eldridge MD, Gale D, Stewart GD, Burge J, Cooper WN, Van Der Heijden MS, Massie CE, Watts C, Corrie P, Pacey S, Brindle KM, Baird RD, Mau-Sørensen M, Parkinson CA, Smith CG, Brenton JD, Rosenfeld N (2018). „Vylepšená detekce cirkulující nádorové DNA analýzou velikosti fragmentu“. Sci Transl Med. 10 (466): eaat4921. doi:10.1126 / scitranslmed.aat4921. PMC  6483061. PMID  30404863.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  12. ^ A b Pisetsky DS, Fairhurst AM (červen 2007). "Původ extracelulární DNA během čištění mrtvých a umírajících buněk". Autoimunita. 40 (4): 281–4. doi:10.1080/08916930701358826. PMID  17516210. S2CID  11499768.
  13. ^ Vasioukhin V, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Stroun M (duben 1994). „Bodové mutace genu N-ras v DNA krevní plazmy pacientů s myelodysplastickým syndromem nebo akutní myeloidní leukémií“. British Journal of Hematology. 86 (4): 774–779. doi:10.1111 / j.1365-2141.1994.tb04828.x. PMID  7918071. S2CID  26365875.
  14. ^ Vasioukhin V, Stroun M, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Anker P (květen 1994). „Bodové mutace K-ras v DNA krevní plazmy pacientů s kolorektálními tumory“. Výzvy moderní medicíny: biotechnologie dnes. 5: 141–150.
  15. ^ Yong E (červenec 2014). "Biomarkery rakoviny: psané krví". Příroda. 511 (7511): 524–526. Bibcode:2014Natur.511..524Y. doi:10.1038 / 511524a. PMID  25079538. S2CID  4445938.
  16. ^ Xue X, MD Teare, Holen I, Zhu YM, Woll PJ (červen 2009). „Optimalizace výtěžku a užitečnosti cirkulující bezbuněčné DNA z plazmy a séra“ (PDF). Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 404 (2): 100–4. doi:10.1016 / j.cca.2009.02.018. PMID  19281804.
  17. ^ Norton SE, Lechner JM, Williams T, Fernando MR (říjen 2013). „Stabilizační činidlo zabraňuje kontaminaci bezbuněčné DNA buněčnou DNA v plazmě během skladování a přepravy krevního vzorku, jak stanoví digitální PCR.“. Klinická biochemie. 46 (15): 1561–5. doi:10.1016 / j.clinbiochem.2013.06.002. PMID  23769817.
  18. ^ A b C Sherwood JL, Corcoran C, Brown H, Sharpe AD, Musilova M, Kohlmann A (2016). „Optimalizované předanalytické metody zlepšují detekci mutací KRAS v DNA cirkulujícího tumoru (ctDNA) u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC)“. PLOS ONE. 11 (2): e0150197. Bibcode:2016PLoSO..1150197S. doi:10.1371 / journal.pone.0150197. PMC  4769175. PMID  26918901.
  19. ^ Vallée A, Marcq M, Bizieux A, Kouri CE, Lacroix H, Bennouna J, Douillard JY, Denis MG (listopad 2013). „Plazma je lepším zdrojem cirkulující bezbuněčné DNA odvozené od tumoru než sérum pro detekci alterací EGFR u pacientů s plicním tumorem.“ Rakovina plic. 82 (2): 373–4. doi:10.1016 / j.lungcan.2013.08.014. PMID  24007628.
  20. ^ Lee TH, Montalvo L, Chrebtow V, Busch MP (únor 2001). "Kvantifikace genomové DNA ve vzorcích plazmy a séra: vyšší koncentrace genomové DNA nalezené v séru než v plazmě". Transfúze. 41 (2): 276–82. doi:10.1046 / j.1537-2995.2001.41020276.x. PMID  11239235. S2CID  45714834.
  21. ^ Qin Z, Ljubimov VA, Zhou C, Tong Y, Liang J (duben 2016). „Bezbuněčná cirkulující nádorová DNA u rakoviny“. Čínský deník rakoviny. 35: 36. doi:10.1186 / s40880-016-0092-4. PMC  4823888. PMID  27056366.
  22. ^ A b C d E F G Heitzer E, Ulz P, Geigl JB (leden 2015). „Cirkulující DNA nádoru jako kapalná biopsie pro rakovinu“. Klinická chemie. 61 (1): 112–23. doi:10.1373 / clinchem.2014.222679. PMID  25388429.
  23. ^ van der Pol Y, Mouliere F (2019). „Směrem k včasnému odhalení rakoviny dekódováním epigenetických a environmentálních otisků bezbuněčné DNA“. Rakovinová buňka. 36 (4): 350–368. doi:10.1016 / j.ccell.2019.09.003. PMID  31614115.
  24. ^ Mouliere F, Chandrananda D, Piskorz AM, Moore EK, Morris J, Ahlborn LB, Mair R, Goranova T, Marass F, Heider K, Wan JCM, Supernat A, Hudecova I, Gounaris I, Ros S, Jimenez-Linan M, Garcia-Corbacho J, Patel K, Østrup O, Murphy S, Eldridge MD, Gale D, Stewart GD, Burge J, Cooper WN, Van Der Heijden MS, Massie CE, Watts C, Corrie P, Pacey S, Brindle KM, Baird RD, Mau-Sørensen M, Parkinson CA, Smith CG, Brenton JD, Rosenfeld N (2018). „Vylepšená detekce cirkulující nádorové DNA analýzou velikosti fragmentu“. Sci Transl Med. 10 (466): eaat4921. doi:10.1126 / scitranslmed.aat4921. PMC  6483061. PMID  30404863.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  25. ^ A b C Leary RJ, Sausen M, Kinde I, Papadopoulos N, Carpten JD, Craig D, O'Shaughnessy J, Kinzler KW, Parmigiani G, Vogelstein B, Diaz LA, Velculescu VE (listopad 2012). „Detekce chromozomálních změn v oběhu pacientů s rakovinou pomocí sekvenování celého genomu“. Science Translational Medicine. 4 (162): 162ra154. doi:10.1126 / scitranslmed.3004742. PMC  3641759. PMID  23197571.
  26. ^ Preobrazhenskiĭ BS (1966). „[Současné perspektivy a metoda systematické léčby kochleární neuritidy a chronické labyrinthopatie]“. Vestnik Otorinolaringologii (v Rusku). 28 (1): 3–11. PMID  5988180.
  27. ^ Beaumont G, Dobbins S, Latta D, McMillin WP (květen 1990). "Mequitazin při léčbě senné rýmy". Britský žurnál klinické praxe. 44 (5): 183–8. PMID  1975200.
  28. ^ Li W, Zhang X, Lu X, You L, Song Y, Luo Z a kol. (Říjen 2017). „Podpisy 5-hydroxymethylcytosinu v cirkulující bezbuněčné DNA jako diagnostické biomarkery pro lidské rakoviny“. Cell Research. 27 (10): 1243–1257. doi:10.1038 / cr.2017.121. PMC  5630683. PMID  28925386.
  29. ^ Song CX, Yin S, Ma L, Wheeler A, Chen Y, Zhang Y, Liu B, Xiong J, Zhang W, Hu J, Zhou Z, Dong B, Tian Z, Jeffrey SS, Chua MS, So S, Li W „Wei Y, Diao J, Xie D, Quake SR (říjen 2017). „Podpisy 5-hydroxymethylcytosinu v bezbuněčné DNA poskytují informace o typech a stadiích nádorů“. Cell Research. 27 (10): 1231–1242. doi:10.1038 / cr.2017.106. PMC  5630676. PMID  28820176.
  30. ^ A b C d E F Butler TM, Spellman PT, Gray J (únor 2017). "DNA v oběhu jako nástroj včasné detekce a diagnostiky". Aktuální názor na genetiku a vývoj. 42: 14–21. doi:10.1016 / j.gde.2016.12.003. PMID  28126649.
  31. ^ Dressman D, Yan H, Traverso G, Kinzler KW, Vogelstein B (červenec 2003). „Transformace jednotlivých molekul DNA na fluorescenční magnetické částice pro detekci a stanovení počtu genetických variací“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 100 (15): 8817–22. Bibcode:2003PNAS..100.8817D. doi:10.1073 / pnas.1133470100. PMC  166396. PMID  12857956.
  32. ^ Diehl F, Li M, He Y, Kinzler KW, Vogelstein B, Dressman D (červenec 2006). „BEAMing: jednokomolekulární PCR na mikročásticích v emulzích voda v oleji“. Přírodní metody. 3 (7): 551–9. doi:10.1038 / nmeth898. PMID  16791214. S2CID  7059151.
  33. ^ Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, Liu CL, Neal JW, Wakelee HA, Merritt RE, Shrager JB, Loo BW, Alizadeh AA, Diehn M (květen 2014). „Ultrasenzitivní metoda pro kvantifikaci cirkulující nádorové DNA se širokým pokrytím pacientů“. Přírodní medicína. 20 (5): 548–54. doi:10,1038 / nm. 3519. PMC  4016134. PMID  24705333.
  34. ^ A b Newman AM, Lovejoy AF, Klass DM, Kurtz DM, Chabon JJ, Scherer F a kol. (Květen 2016). „Integrované potlačení digitálních chyb pro lepší detekci cirkulující nádorové DNA“. Přírodní biotechnologie. 34 (5): 547–555. doi:10.1038 / nbt.3520. PMC  4907374. PMID  27018799.
  35. ^ Forshew T, Murtaza M, Parkinson C, Gale D, Tsui DW, Kaper F, Dawson SJ, Piskorz AM, Jimenez-Linan M, Bentley D, Hadfield J, květen AP, Caldas C, Brenton JD, Rosenfeld N (květen 2012) . "Neinvazivní identifikace a monitorování rakovinových mutací cíleným hloubkovým sekvenováním plazmatické DNA". Science Translational Medicine. 4 (136): 136ra68. doi:10.1126 / scitranslmed.3003726. PMID  22649089. S2CID  34723244.
  36. ^ Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, Kinzler KW, Vogelstein B (červen 2011). „Detekce a kvantifikace vzácných mutací s masivně paralelním sekvenováním“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 108 (23): 9530–5. Bibcode:2011PNAS..108,9530K. doi:10.1073 / pnas.1105422108. PMC  3111315. PMID  21586637.
  37. ^ Kennedy SR, Schmitt MW, Fox EJ, Kohrn BF, Salk JJ, Ahn EH, Prindle MJ, Kuong KJ, Shen JC, Risques RA, Loeb LA (listopad 2014). „Detekce ultravysokofrekvenčních mutací pomocí duplexního sekvenování“. Přírodní protokoly. 9 (11): 2586–606. doi:10.1038 / nprot.2014.170. PMC  4271547. PMID  25299156.
  38. ^ Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A (2016). „Cirkulující biomarkery pro sledování progrese a léčby rakoviny“. Výpočetní a strukturální biotechnologický časopis. 14: 211–22. doi:10.1016 / j.csbj.2016.05.004. PMC  4913179. PMID  27358717.
  39. ^ Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, Bardelli A (srpen 2013). „Tekutá biopsie: sledování genetiky rakoviny v krvi“. Recenze přírody. Klinická onkologie. 10 (8): 472–84. doi:10.1038 / nrclinonc.2013.110. PMID  23836314. S2CID  25537784.
  40. ^ Murtaza M, Dawson SJ, Pogrebniak K, Rueda OM, Provenzano E, Grant J, Chin SF, Tsui DW, Marass F, Gale D, Ali HR, Shah P, Contente-Cuomo T, Farahani H, Shumansky K, Kingsbury Z, Humphray S, Bentley D, Shah SP, Wallis M, Rosenfeld N, Caldas C (listopad 2015). „Multifokální klonální evoluce charakterizovaná použitím cirkulující nádorové DNA v případě metastatického karcinomu prsu“. Příroda komunikace. 6: 8760. Bibcode:2015NatCo ... 6,8760 mil. doi:10.1038 / ncomms9760. PMC  4659935. PMID  26530965.
  41. ^ van der Pol Y, Mouliere F (2019). „Směrem k včasnému odhalení rakoviny dekódováním epigenetických a environmentálních otisků bezbuněčné DNA“. Rakovinová buňka. 36 (4): 350–368. doi:10.1016 / j.ccell.2019.09.003. PMID  31614115.

Další čtení