Bisulfitové sekvenování - Bisulfite sequencing

Obrázek 1: Nástin konverze bisulfitu sekvence vzorku genomové DNA. Nukleotidy v modré barvě jsou nemetylované cytosiny přeměněné na uracily bisulfitem, zatímco červené nukleotidy jsou 5-methylcytosiny rezistentní na přeměnu.
Obrázek 2: Nástin chemické reakce, která je základem bisulfitem katalyzované konverze cytosinu na uracil.

Hydrogensiřičitan[1] sekvenování (také známý jako bisulfitové sekvenování) je použití hydrogensiřičitan léčba DNA před rutinou sekvenování určit vzor methylace. Methylace DNA byl první objevený epigenetický známkou a zůstává nejvíce studovaným. U zvířat zahrnuje převážně přidání a methylová skupina do polohy uhlíku-5 cytosin zbytky dinukleotidu CpG, a podílí se na represi vůči transkripční aktivita.

Ošetření DNA hydrogensiřičitanem převádí cytosinové zbytky na uracil, ale odejde 5-methylcytosin zbytky neovlivněny. Proto si DNA, která byla ošetřena hydrogensiřičitanem, zachovává pouze methylované cytosiny. Bisulfitové zpracování tedy zavádí specifické změny v Sekvence DNA které závisí na stavu methylace jednotlivých zbytků cytosinu, čímž se získají informace o rozlišení jednoho nukleotidu o stavu methylace segmentu DNA. K získání těchto informací lze na změněné sekvenci provést různé analýzy. Cíl této analýzy se proto omezuje na rozlišení mezi jednonukleotidové polymorfismy (cytosiny a thymidin ), který je výsledkem konverze hydrogensiřičitanu (obrázek 1).

Metody

Bisulfitové sekvenování aplikuje rutinní metody sekvenování na genomovou DNA ošetřenou hydrogensiřičitanem k určení stavu methylace na CpG dinukleotidech. K vyšetřování methylace na konkrétních lokusech nebo v a. Se také používají jiné nesekvenční strategie genom - na celé úrovni. Všechny strategie předpokládají, že přeměna nemethylovaných cytosinů na uracil vyvolaná hydrogensiřičitanem je úplná, a to slouží jako základ všech následujících technik. V ideálním případě by použitá metoda určovala stav methylace zvlášť pro každou z nich alela. Alternativní metody k bisulfitovému sekvenování zahrnují Kombinovaná analýza omezení bisulfitu a imunoprecipitace methylované DNA (MeDIP).

Metodiky analýzy DNA upravené hydrogensiřičitanem jsou neustále vyvíjeny. Abychom shrnuli tyto rychle se rozvíjející metodiky, bylo napsáno mnoho recenzních článků.[2][3][4][5]

Metodiky lze obecně rozdělit na strategie založené na methylačně specifické PCR (MSP) (obrázek 4) a strategie využívající polymerázová řetězová reakce (PCR) prováděné za nemethylačně specifických podmínek (obrázek 3). Metody založené na mikročipech používají také PCR založenou na podmínkách, které nejsou specifické pro methylaci.

Metody založené na nemetylační specifické PCR

Obrázek 3: Metody analýzy methylace DNA, které nejsou založeny na methylačně specifické PCR. Po konverzi hydrogensiřičitanem je genomová DNA amplifikována pomocí PCR, která nerozlišuje mezi methylovanými a nemetylovanými sekvencemi. Četné dostupné metody se poté používají k diskriminaci na základě změn v amplikonu v důsledku konverze hydrogensiřičitanu.

Přímé řazení

První popsaná metoda methylační analýzy za použití DNA ošetřené hydrogensiřičitanem využívala PCR a standardní dideoxynukleotid Sekvenování DNA k přímému stanovení nukleotidů rezistentních na konverzi hydrogensiřičitanu.[6] Primery jsou navrženy tak, aby byly specifické pro řetězec i specifické pro siřičitany (tj. Primery obsahující cytoziny bez CpG, takže nejsou komplementární s DNA neošetřenou bisulfitem), ohraničující (ale nezahrnující) požadované methylační místo. Proto bude na rozdíl od methylačně specifické PCR amplifikovat methylované i nemetylované sekvence. Všechny stránky nemetylovaných cytosinů jsou zobrazeny jako tyminy ve výsledné amplifikované sekvenci sense řetězce a jako adeniny v zesíleném antisense pramen. Začleněním vysoce výkonných sekvenčních adaptérů do PCR primerů lze produkty PCR sekvenovat masivně paralelním sekvenováním. Alternativně a pracně lze produkt PCR klonovat a sekvenovat. Vnořená PCR k vylepšení produktu pro sekvenování.

Všechny následující techniky analýzy methylace DNA s použitím DNA upravené hydrogensiřičitanem jsou založeny na této zprávě Frommer et al. (Obrázek 2).[6] Ačkoli většina ostatních modalit není technikami založenými na sekvenování, termín „bisulfitové sekvenování“ se často používá k obecnému popisu metod methylační DNA-methylační konverze.

Pyrosekvenování

Pyrosekvenování byl také použit k analýze DNA ošetřené hydrogensiřičitanem bez použití methylačně specifické PCR.[7][8] Po PCR amplifikaci zájmové oblasti se používá pyrosekvenování ke stanovení sekvence specifické pro hydrogensiřičitan CpG stránky v oblasti. Poměr C-k-T na jednotlivých místech lze určit kvantitativně na základě množství začlenění C a T během prodloužení sekvence. Hlavním omezením této metody jsou náklady na technologii. Pyrosekvenování však umožňuje rozšíření na vysoce výkonný screening metody.

Další vylepšení této techniky nedávno popsali Wong et al., Kteří používají alelově specifické primery, které se začleňují jedno-nukleotidové polymorfismy do sekvence sekvenčního primeru, což umožňuje samostatnou analýzu mateřské a otcovské alely.[9] Tato technika je zvláště užitečná pro genomový otisk analýza.

Methylačně citlivá jednovláknová konformační analýza (MS-SSCA)

Tato metoda je založena na jednovláknový konformační polymorfismus metoda analýzy (SSCA) vyvinutá pro jedno-nukleotidový polymorfismus (SNP) analýza.[10] SSCA rozlišuje mezi jednořetězcovými fragmenty DNA stejné velikosti, ale odlišné sekvence na základě diferenciální migrace v nedenaturujících elektroforéza. V MS-SSCA se to používá k rozlišení mezi bisulfitem ošetřenými, PCR amplifikovanými oblastmi obsahujícími požadovaná CpG místa. Ačkoli SSCA postrádá citlivost, když je jen jeden nukleotid rozdíl je přítomen, léčba hydrogensiřičitanem často vede k řadě konverzí C-T ve většině oblastí zájmu a výsledná citlivost se blíží 100%. MS-SSCA také poskytuje semikvantitativní analýzu stupně methylace DNA na základě poměru intenzit pásma. Tato metoda je však navržena k posouzení všech CpG stránky spíše jako celek v zájmové oblasti než jednotlivá methylační místa.

Analýza tavení s vysokým rozlišením (HRM)

Další metodou pro diferenciaci převedené z nekonvertované bisulfitově upravené DNA je použití analýzy tavení s vysokým rozlišením (HRM), kvantitativní PCR - technika založená původně na rozlišení SNP.[11] PCR amplikony jsou analyzovány přímo teplotním náběhem a výsledným uvolněním interkalačního fluorescenční barvivo během tavení. Stupeň methylace, vyjádřený obsahem C-T v T amplikon, určuje rychlost tání a následné uvolnění barviva. Tato metoda umožňuje přímou kvantifikaci v testu s jednou zkumavkou, ale hodnotí methylaci v amplifikované oblasti jako celek, spíše než na konkrétní CpG stránky.

Prodloužení jednoho nukleotidového primeru citlivé na metylaci (MS-SnuPE)

MS-SnuPE využívá metodu extenze primeru původně navrženou pro analýzu jedno-nukleotidové polymorfismy.[12] DNA je konvertována na bisulfit a primery specifické pro hydrogensiřičitany jsou napojeny na sekvenci až k páru bází bezprostředně před požadovanou CpG. Primeru je dovoleno prodloužit jeden pár bází do C (nebo T) použitím DNA polymeráza ukončení dideoxynukleotidy a poměr C k T je stanoven kvantitativně.

K určení tohoto poměru C: T lze použít řadu metod. Na začátku se MS-SnuPE spoléhal na radioaktivní ddNTP jako reportér prodloužení primeru. Metody založené na fluorescenci nebo Pyrosekvenování lze také použít.[13] Laserová desorpční ionizace s asistovanou matricí / doba letu (MALDI-TOF ) hmotnostní spektrometrie lze v zásadě použít analýzu k rozlišení mezi dvěma produkty rozšíření polymorfního primeru, založenou na DOBRÉM testu určeném pro Genotypizace SNP. Iontový pár v reverzní fázi vysoce účinná kapalinová chromatografie (IP-RP-HPLC ) byl také použit k rozlišení produktů prodlužujících primer.[14]

Štěpení specifické pro základnu / MALDI-TOF

Nedávno popsaná metoda Ehrich et al. dále využívá výhod konverzí hydrogensiřičitanů přidáním kroku štěpení specifického pro bázi, aby se posílily informace získané ze změn nukleotidů.[15] Nejprve pomocí in vitro transkripce oblasti zájmu do RNA (přidáním RNA polymeráza promotér místo k PCR primeru v počáteční amplifikaci), RNáza A lze použít k štěpení RNA přepis na místech specifických pro základnu. Tak jako RNáza A štěpí RNA konkrétně na cytosinu a uracilu ribonukleotidy, základní specificity je dosaženo přidáním začlenění odolného proti štěpení dTTP když je požadováno cytosinově specifické (C-specifické) štěpení, a začlenění dCTP, když je požadováno uracil-specifické (U-specifické) štěpení. Štěpené fragmenty pak mohou být analyzovány pomocí MALDI-TOF. Výsledkem ošetření hydrogensiřičitanem je buď zavedení / odstranění štěpných míst konverzí C-to-U, nebo posun hmotnosti fragmentu konverzí G-to-A v amplifikovaném reverzním řetězci. C-specifické štěpení se bude specificky snižovat u všech methylovaných CpG stránky. Analýzou velikostí výsledných fragmentů je možné určit specifický vzorec methylace DNA CpG stránky v rámci regionu, spíše než určovat rozsah methylace regionu jako celku. Tato metoda prokázala účinnost pro vysoce výkonný screening, což umožňuje výslech mnoha CpG stránky ve více tkáních nákladově efektivním způsobem.

Methylačně specifická PCR (MSP)

Obrázek 4: Methylačně specifická PCR je citlivá metoda pro diskriminační amplifikaci a detekci požadované methylované oblasti pomocí methylovaných specifických primerů na genomové DNA konvertované na siřičitan. Takové primery budou hybridizovat pouze se sekvencemi, které jsou methylované a tedy obsahují 5-methylcytosiny které jsou odolné vůči přeměně hydrogensiřičitanem. Alternativně lze použít primery specifické pro nemethylovanou skupinu.

Tato alternativní metoda methylační analýzy také používá DNA upravenou hydrogensiřičitanem, ale vyhýbá se nutnosti sekvenovat sledovanou oblast.[16] Místo toho jsou páry primerů samy navrženy tak, aby byly „methylově specifické“ zahrnutím sekvencí doplňujících pouze nepřeměněné 5-methylcytosiny, nebo naopak, „nemetylovaný specifický“, doplňující tyminy převedeny z nemetylovaných cytosinů. Methylace je určena schopností specifického primeru dosáhnout amplifikace. Tato metoda je zvláště užitečná k výslechu CpG ostrovy s možná vysokou hustotou methylace, protože zvýšený počet párů CpG v primeru zvyšuje specificitu testu. Umístění páru CpG na 3'-konec primeru také zlepšuje citlivost. Počáteční zpráva používající MSP popisovala dostatečnou citlivost k detekci methylace 0,1% z alely. Obecně se MSP a související protokoly považují za nejcitlivější při dotazování stavu methylace u konkrétního místo.

Metoda MethyLight je založena na MSP, ale poskytuje kvantitativní analýzu pomocí kvantitativní PCR.[17] Používají se methylované specifické primery a také se používá methylově specifická fluorescenční reportérová sonda, která nasedá na amplifikovanou oblast. Alternativně mohou být primery nebo sonda navrženy bez metylační specificity, pokud je nutná diskriminace mezi páry CpG v zapojených sekvencích. Kvantifikace se provádí s odkazem na methylovanou referenční DNA. Modifikace tohoto protokolu ke zvýšení specificity PCR pro úspěšně bisulfitem konvertovanou DNA (ConLight-MSP) používá další sondu k bisulfitově nekonvertované DNA ke kvantifikaci této nespecifické amplifikace.[18]

Další metodologie používající MSP amplifikovanou DNA analyzuje produkty pomocí analýza křivky tání (Mc-MSP).[19] Tato metoda amplifikuje bisulfitem konvertovanou DNA s methylově specifickými i nemetylovanými specifickými primery a určuje kvantitativní poměr těchto dvou produktů porovnáním diferenciálních píků generovaných analýzou křivky tání. Metoda analýzy tavení s vysokým rozlišením, která využívá obojí kvantitativní PCR a byla zavedena analýza tání, zejména pro citlivou detekci nízkoúrovňové methylace[20]

Metody založené na microarray

Microarray Metody založené na metodách jsou logickým rozšířením technologií dostupných pro analýzu DNA ošetřené hydrogensiřičitanem, aby umožnily analýzu methylace v celém genomu.[21] Oligonukleotidové mikročipy jsou navrženy pomocí párů oligonukleotid hybridizační sondy cílení CpG stránky zájmu. Jeden je komplementární k nezměněné methylované sekvenci a druhý je komplementární k nemetylované sekvenci převedené na C-U. Sondy jsou také specifické pro hydrogensiřičitany, aby se zabránilo navázání na DNA neúplně převedenou hydrogensiřičitanem. The Methylační test Illumina je jedním z takových testů, které používají technologii hydrogensiřičitanového sekvenování na úrovni microarray pro generování methylačních dat v celém genomu.

Omezení

5-Hydroxymethylcytosin

Bisulfitové sekvenování je široce používáno v genomech savců, avšak objevily se komplikace s objevem nové modifikace DNA savců 5-hydroxymethylcytosin.[22][23] 5-Hydroxymethylcytosin se po zpracování hydrogensiřičitanem převede na cytosin-5-methylsulfonát, který se po sekvenování přečte jako C.[24] Bisulfitové sekvenování proto nemůže rozlišovat mezi 5-methylcytosinem a 5-hydroxymethylcytosinem. To znamená, že výstup z bisulfitového sekvenování již nelze definovat pouze jako methylaci DNA, protože jde o směs 5-methylcytosinu a 5-hydroxymethylcytosinu. Vývoj sekvenování oxidativního hydrogensiřičitanu s pomocí Tet Chuan He na University of Chicago je nyní schopen rozlišit mezi těmito dvěma modifikacemi při rozlišení jedné základny.[25]

Neúplná konverze

Bisulfitové sekvenování se opírá o přeměnu každého jednoho nemetylovaného cytosinového zbytku na uracil. Pokud je konverze neúplná, následná analýza nesprávně interpretuje nepřeměněné nemetylované cytosiny jako methylované cytosiny, což vede k falešně pozitivní výsledky pro methylaci. Pouze cytosiny v jednořetězcové DNA jsou proto náchylné k napadení hydrogensiřičitanem denaturace DNA podstupující analýzu je kritická.[2] Je důležité zajistit, aby parametry reakce, jako je teplota a koncentrace soli, byly vhodné k udržení DNA v jednovláknové konformaci a umožnění úplné přeměny. Vložení DNA do agaróza Uvádí se, že gel zlepšuje rychlost přeměny tím, že udržuje řetězce DNA fyzicky oddělené.[26]

Degradace DNA během zpracování hydrogensiřičitanem

Hlavní výzvou v bisulfitovém sekvenování je degradace DNA, která probíhá současně s přeměnou. Podmínky nezbytné pro úplnou konverzi, jako jsou dlouhé inkubační doby, zvýšená teplota a vysoká koncentrace hydrogensiřičitanu, mohou vést k degradaci asi 90% inkubované DNA.[27] Vzhledem k tomu, že počáteční množství DNA je často omezené, může být taková rozsáhlá degradace problematická. K degradaci dochází jako depurinace což má za následek náhodné přetržení vlákna.[28] Proto čím delší je požadovaná PCR amplikon, tím omezenější bude pravděpodobně počet intaktních templátových molekul. To by mohlo vést k selhání amplifikace PCR nebo ke ztrátě kvantitativně přesných informací o úrovních methylace v důsledku omezeného vzorkování templátových molekul. Je tedy důležité posoudit míru degradace DNA vyplývající z použitých reakčních podmínek a zvážit, jak to ovlivní žádoucí amplikon. Lze také použít techniky k minimalizaci degradace DNA, jako je cyklování inkubační teploty.[28]

Další obavy

Potenciálně významný problém po zpracování hydrogensiřičitanem je neúplný desulfonace z pyrimidin zbytky v důsledku nedostatečné alkalizace roztoku. To může některé brzdit DNA polymerázy, což ztěžuje následnou PCR. Této situaci je však možné zabránit monitorováním pH řešení, aby bylo zajištěno, že desulfonace bude kompletní.[2]

Posledním problémem je, že ošetření hydrogensiřičitanem výrazně snižuje úroveň složitosti vzorku, což může být problematické, pokud má být provedeno několik PCR reakcí (2006).[5] Primer design je obtížnější a častější je nevhodná křížová hybridizace.

Aplikace: methylační analýza v celém genomu

Pokroky v bisulfitovém sekvenování vedly k možnosti jejich použití při a genom v širokém měřítku, kde dříve byla globální míra methylace DNA možná pouze za použití jiných technik, jako např Genomické skenování omezení. Mapování člověka epigenom je viděn mnoha vědci jako logické pokračování po dokončení Projekt lidského genomu.[29][30] Tato epigenomická informace bude důležitá pro pochopení toho, jak je implementována a regulována funkce genetické sekvence. Vzhledem k tomu, že epigenom je méně stabilní než genom, považuje se to za důležité interakce gen-prostředí.[31]

Epigenomické mapování je ze své podstaty složitější než sekvenování genomu, ale protože epigenom je mnohem variabilnější než genom. Epigenom člověka se mění s věkem, liší se mezi tkáněmi, mění se vlivy prostředí a vykazuje aberace u nemocí. Takové bohaté epigenomické mapování, představující různý věk, typy tkání a chorobné stavy, by však přineslo cenné informace o normální funkci epigenetický známky a mechanismy vedoucí ke stárnutí a nemocem.

Mezi přímé výhody epigenomického mapování patří pravděpodobný pokrok v klonování technologie. Předpokládá se, že selhání produkce klónovaných zvířat s normální životaschopností a délkou života vyplývá z nevhodných vzorů epigenetických znaků. U mnoha jsou také dobře charakterizovány odchylné methylační vzorce rakoviny. Globální hypomethylace vede ke snížení genomové stability, zatímco lokální hypermethylace z gen potlačující nádor promotéři často odpovídá za jejich ztráta funkce. Specifické vzorce methylace svědčí o konkrétních typech rakoviny prognostický hodnotu a může pomoci vést nejlepší postup léčby.[30]

Rozsáhlé snahy o mapování epigenomů probíhají po celém světě a byly organizovány v rámci EU Projekt lidského epigenomu.[31] To je založeno na víceúrovňové strategii, kdy se pro získání methylačních profilů s vysokým rozlišením pro omezený počet referenčních epigenomů používá bisulfitové sekvenování, zatímco u širšího spektra vzorků se provádí méně důkladná analýza. Tento přístup je určen k maximalizaci vhledu získaného z daného množství zdrojů, protože mapování celého genomu s vysokým rozlišením zůstává nákladným úkolem.

Ukázalo se, že analýza genové sady (například pomocí nástrojů jako DAVID a GoSeq) je při použití na vysoce výkonná metylační data (např. Sekvenační sekvence bisulfitu v celém genomu) velmi zkreslená; bylo navrženo, že to může být opraveno pomocí permutací štítku vzorku nebo pomocí statistického modelu ke kontrole rozdílů v počtu CpG sond / CpG míst, která cílí na každý gen.[32]

Oxidační bisulfitové sekvenování

5-Methylcytosin a 5-hydroxymethylcytosin se čte jako C v bisulfitovém sekvenování.[24] Oxidační bisulfitové sekvenování je metoda pro rozlišení mezi 5-methylcytosinem a 5-hydroxymethylcytosinem při rozlišení jedné báze. Tato metoda využívá specifickou (Tet-asistovanou) chemickou oxidaci 5-hydroxymethylcytosinu na 5-formylcytosin, který se během zpracování hydrogensiřičitanem následně převede na uracil.[33] Jedinou bází, která se poté čte jako C, je 5-methylcytosin, který poskytuje mapu skutečného stavu methylace ve vzorku DNA. Hladiny 5-hydroxymethylcytosinu lze také kvantifikovat měřením rozdílu mezi bisulfitovým a oxidativním bisulfitovým sekvenováním.

Viz také

Reference

  1. ^ Chatterjee A, Stockwell PA, Rodger EJ a Morison IM 2012. Srovnání srovnávacího softwaru pro data sekvence bisulfitových sekvencí v celém genomu. Výzkum nukleových kyselin 40 (10): e79.
  2. ^ A b C Fraga MF, Esteller M (září 2002). „Methylace DNA: profil metod a aplikací“. Biotechniky. 33 (3): 632, 634, 636–49. doi:10.2144 / 02333rv01. PMID  12238773.
  3. ^ El-Maarri O (2003). "Metody: methylace DNA". Peroxisomální poruchy a regulace genů. Pokroky v experimentální medicíně a biologii. 544. 197–204. doi:10.1007/978-1-4419-9072-3_23. ISBN  978-0-306-48174-1. PMID  14713229.
  4. ^ Laird PW (duben 2003). „Síla a příslib markerů methylace DNA“. Recenze přírody. Rakovina. 3 (4): 253–66. doi:10.1038 / nrc1045. PMID  12671664. S2CID  19574628.
  5. ^ A b Callinan PA, Feinberg AP (duben 2006). „Vznikající věda o epigenomice“. Lidská molekulární genetika. 15 Spec No 1 (90001): R95-101. doi:10,1093 / hmg / ddl095. PMID  16651376.
  6. ^ A b Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW a kol. (Březen 1992). „Protokol genomového sekvenování, který poskytuje pozitivní zobrazení zbytků 5-methylcytosinu v jednotlivých řetězcích DNA“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 89 (5): 1827–31. Bibcode:1992PNAS ... 89.1827F. doi:10.1073 / pnas.89.5.1827. PMC  48546. PMID  1542678.
  7. ^ Colella S, Shen L, Baggerly KA, Issa JP, Krahe R (červenec 2003). „Citlivá a kvantitativní univerzální pyrosekvenční methylační analýza CpG stránek“. Biotechniky. 35 (1): 146–50. doi:10.2144 / 03351md01. PMID  12866414.
  8. ^ Tost J, Dunker J, Gut IG (červenec 2003). „Analýza a kvantifikace různých poloh methylačních proměnných na ostrovech CpG pomocí pyrosekvenování“. Biotechniky. 35 (1): 152–6. doi:10.2144 / 03351md02. PMID  12866415.
  9. ^ Wong HL, Byun HM, Kwan JM, Campan M, Ingles SA, Laird PW, Yang AS (prosinec 2006). „Rychlá a kvantitativní metoda alelicky specifické analýzy methylace DNA“. Biotechniky. 41 (6): 734–9. doi:10.2144/000112305. PMID  17191619.[trvalý mrtvý odkaz ]
  10. ^ Bianco T, Hussey D, Dobrovic A (1999). „Methylačně citlivá, jednořetězcová konformační analýza (MS-SSCA): Rychlá metoda pro screening a analýzu methylace“. Lidská mutace. 14 (4): 289–93. doi:10.1002 / (SICI) 1098-1004 (199910) 14: 4 <289 :: AID-HUMU3> 3.0.CO; 2-A. PMID  10502775.
  11. ^ Wojdacz TK, Dobrovic A (2007). „Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation“. Výzkum nukleových kyselin. 35 (6): e41. doi:10.1093 / nar / gkm013. PMC  1874596. PMID  17289753.
  12. ^ Gonzalgo ML, Jones PA (červen 1997). „Rychlá kvantifikace methylačních rozdílů na konkrétních místech pomocí methylačně citlivého prodloužení jednoho nukleotidového primeru (Ms-SNuPE)“. Výzkum nukleových kyselin. 25 (12): 2529–31. doi:10.1093 / nar / 25.12.2529. PMC  146734. PMID  9171109.
  13. ^ Uhlmann K, Brinckmann A, Toliat MR, Ritter H, Nürnberg P (prosinec 2002). „Hodnocení potenciálního epigenetického biomarkeru kvantitativní analýzou polymorfismu methyl-jediného nukleotidu“. Elektroforéza. 23 (24): 4072–9. doi:10.1002 / elps.200290023. PMID  12481262. S2CID  43737807.
  14. ^ Matin MM, Baumer A, Hornby DP (říjen 2002). "Analytická metoda pro detekci methylačních rozdílů na specifických chromozomálních lokusech za použití extenze primeru a HPLC na reverzní fázi iontových párů". Lidská mutace. 20 (4): 305–11. doi:10.1002 / humu.10118. PMID  12325026.
  15. ^ Ehrich M, Nelson MR, Stanssens P, Zabeau M, Liloglou T, Xinarianos G a kol. (Listopad 2005). „Kvantitativní analýza s vysokou propustností methylačních vzorců DNA bazicky specifickým štěpením a hmotnostní spektrometrií“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 102 (44): 15785–90. Bibcode:2005PNAS..10215785E. doi:10.1073 / pnas.0507816102. PMC  1276092. PMID  16243968.
  16. ^ Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (Září 1996). „Methylation-specific PCR: a new PCR assay for methylation status of CpG Islands“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 93 (18): 9821–6. Bibcode:1996PNAS ... 93.9821H. doi:10.1073 / pnas.93.18.9821. PMC  38513. PMID  8790415.
  17. ^ Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D a kol. (Duben 2000). „MethyLight: vysoce výkonný test pro měření methylace DNA“. Výzkum nukleových kyselin. 28 (8): 32e – 0. doi:10.1093 / nar / 28.8.e32. PMC  102836. PMID  10734209.
  18. ^ Rand K, Qu W, Ho T, Clark SJ, Molloy P (červen 2002). „Detekce metylace DNA specifická pro konverzi pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (ConLight-MSP), aby se zabránilo falešným pozitivům“. Metody. 27 (2): 114–20. doi:10.1016 / S1046-2023 (02) 00062-2. PMID  12095268.
  19. ^ Akey DT, Akey JM, Zhang K, Jin L (říjen 2002). „Stanovení methylace DNA na základě vysokokapacitních přístupových křivek tání“. Genomika. 80 (4): 376–84. doi:10.1006 / geno.2002.6851. PMID  12376091.
  20. ^ Kristensen LS, Mikeska T, Krypuy M, Dobrovic A (duben 2008). „Sensitive Melting Analysis after Real Time-Methylation specific PCR (SMART-MSP): high-throughput and proof-free quantitative DNA methylation detection“. Výzkum nukleových kyselin. 36 (7): e42. doi:10.1093 / nar / gkn113. PMC  2367707. PMID  18344521.
  21. ^ Adorján P, Distler J, Lipscher E, Model F, Müller J, Pelet C a kol. (Březen 2002). „Predikce a objev třídy nádorů pomocí metylační analýzy DNA založené na microarray“. Výzkum nukleových kyselin. 30 (5): 21e – 21. doi:10.1093 / nar / 30.5.e21. PMC  101257. PMID  11861926.
  22. ^ Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, BrudnoY a kol. Konverze 5-methylcytosinu na 5-hydroxymethylcytosin u savčí DNA partnerem MLL TET1. Věda. 2009;324(5929):930-5.
  23. ^ Kriaucionis S, Heintz N. Jaderná DNA báze 5-hydroxymethylcytosin je přítomna v Purkyňových neuronech a v mozku. Science.2009; 324 (5929): 929-30.
  24. ^ A b Huang Y, Pastor WA, Shen Y, Tahiliani M, Liu DR, Rao A. Chování 5-hydroxymethylcytosinu v bisulfitovém sekvenování. PLOS ONE.2010; 5 (1): e8888.
  25. ^ Yu, M., Hon, G. C., Szulwach, K. E., Song, C., Jin, P., Ren, B., He, C. Tet-asistované bisulfitové sekvenování 5-hydroxymethylcytosinu. Nat. Protokoly 2012, 7, 2159.
  26. ^ Olek A, Oswald J, Walter J (prosinec 1996). „Upravená a vylepšená metoda pro methylační analýzu cytosinu na bázi hydrogensiřičitanu“. Výzkum nukleových kyselin. 24 (24): 5064–6. doi:10.1093 / nar / 24.24.5064. PMC  146326. PMID  9016686.
  27. ^ Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A (červenec 2001). "Bisulfitové genomové sekvenování: systematické zkoumání kritických experimentálních parametrů". Výzkum nukleových kyselin. 29 (13): E65-5. doi:10.1093 / nar / 29.13.e65. PMC  55789. PMID  11433041.
  28. ^ A b Ehrich M, Zoll S, Sur S, van den Boom D (2007). „Nová metoda pro přesné hodnocení kvality DNA po ošetření hydrogensiřičitanem“. Výzkum nukleových kyselin. 35 (5): e29. doi:10.1093 / nar / gkl1134. PMC  1865059. PMID  17259213.
  29. ^ Esteller M (červen 2006). „Nutnost projektu lidského epigenomu“. Karcinogeneze. 27 (6): 1121–5. doi:10.1093 / carcin / bgl033. PMID  16699174.
  30. ^ A b Bradbury J (prosinec 2003). „Projekt lidského epigenomu - připraven k provozu“. PLOS Biology. 1 (3): E82. doi:10.1371 / journal.pbio.0000082. PMC  300691. PMID  14691553.
  31. ^ A b Jones PA, Martienssen R (prosinec 2005). „Plán projektu Human Epigenome: Workshop AACR Human Epigenome“. Výzkum rakoviny. 65 (24): 11241–6. doi:10.1158 / 0008-5472.CAN-05-3865. PMID  16357125.
  32. ^ Geeleher P, Hartnett L, Egan LJ, Golden A, Raja Ali RA, Seoighe C (srpen 2013). „Analýza genových sad je při použití na metylační data v celém genomu velmi zkreslená“. Bioinformatika. 29 (15): 1851–7. doi:10.1093 / bioinformatika / btt311. PMID  23732277.
  33. ^ Booth MJ, Branco MR, Ficz G, Oxley D, Krueger F, Reik W a kol. kvantitativní sekvenování 5-methylcytosinu a 5-hydroxymethylcytosinu při rozlišení jedné báze. Věda. 2012;336(6083):934-7.

externí odkazy