Apoptotická fragmentace DNA - Apoptotic DNA fragmentation - Wikipedia

Bílé pruhy DNA na tmavě šedém pozadí připomínající příčky žebříku
Apoptotická fragmentace DNA, vizualizovaná Žebříky DNA test (vlevo). A 1 kB popisovač (uprostřed) a řízení DNA (vpravo) jsou zahrnuty pro srovnání.

Apoptotická fragmentace DNA je klíčovou vlastností apoptóza, typ programovaná buněčná smrt. Apoptóza je charakterizována aktivací endogenní endonukleázy, zejména DNáza (CAD) aktivovaná kaspázou-3,[1] s následným štěpením jaderné DNA na internukleozomální fragmenty zhruba 180 základní páry (bp) a jejich násobky (360, 540 atd.). Apoptotická fragmentace DNA se používá jako marker apoptózy a pro identifikaci apoptotických buněk buď prostřednictvím Žebříky DNA test,[2] the Test TUNEL,[3][4] nebo detekcí buněk s frakčním obsahem DNA ("sub G1 buňky ") na histogramech s frekvencí obsahu DNA, např. jako v Stanovení Nicoletti.[5][6]

Mechanismus

Enzym odpovědný za fragmentaci apoptotické DNA je Caspáza-Aoživený DNase (CAD). CAD je normálně inhibován jiným proteinem, JáZákazník Caspáza Aoživený DNase (ICAD). Během apoptózy apoptotická efektorová kaspáza, kaspáza-3, štěpí ICAD a způsobuje tak aktivaci CAD.[7]

Dvojité vlákno DNA omotané kolem jádra histonových proteinů
A nukleosom, skládající se z DNA (šedé) omotané kolem a histon tetramer (barevný). Při fragmentaci apoptotické DNA se DNA štěpí v internukleozomální linker oblast, která je součástí DNA ne omotané kolem histonů.

CAD štěpí DNA na internukleozomální linker weby mezi nukleosomy, struktury obsahující proteiny, které se vyskytují v chromatin v intervalech ~ 180 bp. Je to proto, že DNA je obvykle pevně zabalená histony, jádrové proteiny nukleosomů. Linkerová místa jsou jediné části řetězce DNA, které jsou vystaveny a jsou tak přístupné CAD.

Degradace jaderné DNA na nukleosomální jednotky je jedním ze znaků apoptotické buněčné smrti. Vyskytuje se v reakci na různé apoptotické podněty v široké škále typů buněk. Molekulární charakterizace tohoto procesu identifikovala specifickou DNázu (CAD, DNázou aktivovanou kaspázou), která štěpí chromozomální DNA způsobem závislým na kaspázách. CAD je syntetizován pomocí ICAD (inhibitor CAD), který funguje jako specifický garde pro CAD a nachází se v komplexu s ICAD v proliferujících buňkách. Když jsou buňky indukovány k apoptóze, kaspáza 3 štěpí ICAD, aby disociovala komplex CAD: ICAD, což umožňuje CAD štěpit chromozomální DNA. Buňky, které postrádají ICAD nebo které exprimují mutant ICAD rezistentní na kaspázu, tedy nevykazují fragmentaci DNA během apoptózy, i když vykazují některé další rysy apoptózy a umírají.

I když bylo již provedeno mnoho práce na analýze apoptotických událostí, je k dispozici málo informací, které by spojovaly načasování morfologických znaků na povrchu buňky a v jádru s biochemickou degradací DNA ve stejných buňkách. Apoptózu lze zahájit nesčetným množstvím různých mechanismů v různých typech buněk a kinetika těchto událostí se velmi liší, od několika minut do několika dnů v závislosti na buněčném systému. Přítomnost nebo nepřítomnost konkrétních apoptotických událostí, včetně fragmentace DNA, závisí na „časovém okně“, ve kterém se kinetický proces apoptózy zkoumá. To často může komplikovat identifikaci apoptotických buněk, pokud jsou buněčné populace analyzovány pouze v jednom časovém bodě, např. po indukci apoptózy.

Historické pozadí

Objev internukleozomální fragmentace genomové DNA na pravidelně se opakující oligonukleozomální fragmenty generované endonukleázou závislou na Ca / Mg je přijímán jako jeden z nejlépe charakterizovaných biochemických markerů apoptóza (programovaná buněčná smrt).

V roce 1970 Williamson popsal, že cytoplazmatická DNA izolovaná z myších jaterních buněk po kultivaci byla charakterizována fragmenty DNA s molekulovou hmotností sestávající z násobků 135 kDa. Toto zjištění bylo v souladu s hypotézou, že tyto fragmenty DNA byly specifickým produktem degradace jaderné DNA.[8] V roce 1972 Kerr, Wyllie, a Currie vytvořil termín apoptóza a odlišil tento typ buněčné smrti od nekrózy na základě morfologických znaků.[9] V roce 1973 Hewish a Burgoyne, během studia struktury subchromatinu zjistili, že chromatin je přístupný Ca++/ Mg++ endonukleáza, což vede k tvorbě produktu štěpení s pravidelnou řadou molekulových hmotností podobnou té, kterou dříve popsal Williamson (1970).[10] V roce 1974 Williams, Málo, a Shipleypomocí buněk vystavených velmi rozdílným typům traumatu zjistili, že během buněčné smrti měla degradovaná DNA „v každém případě modální hodnotu mezi 10 (x6) a 10 (x7) Daltonů a k produkci degradace DNA je nutný buněčný metabolismus“ . Toto pozorování však bylo bez indikace, „zda útok incizí na molekulu DNA byl náhodný nebo spíše na konkrétním místě, které mají strukturální nebo funkční význam“.[11] V roce 1976 Scalka, Matyasova, a Čejková popsaná internukleozomální fragmentace ozářené DNA lymfoidního chromatinu in vivo.[12]

Šest let trvalo od roku 1972 do roku 1978/1980 do objevení a vyhodnocení internukleozomální fragmentace DNA během apoptotické buněčné smrti jako znaku apoptózy. Od roku 1972 (Kerr, Wyllie, a Currie[9]), uznává se, že smrt lymfocytů vyvolaná glukokortikoidy je formou apoptózy. V roce 1978 Zakharyan a Pogosyan představil článek odhalující, že degradace DNA indukovaná glukokortikoidy v lymfatické tkáni krysy, brzlíku a slezině se vyskytovala ve specifickém vzoru produkujícím fragmenty DNA, které byly elektroforeticky podobné těm, které byly pozorovány po ošetření chromatinu mikrokokokovou nukleázou, což indikovalo internukleozomální štěpení vzoru DNA během apoptózy došlo k degradaci.[13][14] Byla tedy objevena první souvislost mezi programovanou smrtí / apoptózou buněk a internukleozomální fragmentací chromatinové DNA, která se brzy stala specifickým rysem apoptózy.

V roce 1980 Wyllie uvádí další důkazy pro štěpení vzoru internukleozomální DNA jako specifický rys thymocytů léčených glukokortikoidy, které procházejí apoptózou.[2] Vzorek štěpení internukleozomální DNA byl pozorován jako specifický rys apoptózy v letech 1978/1980 a od té doby se stal uznávaným znakem programované buněčné smrti. V roce 1992 Gorczyca a kol. [3] a Gavrieli a kol.[4] nezávisle popsal Fragmentace DNA test založený na použití terminální deoxynukleotidyltransferáza (TUNEL ), které se staly jednou ze standardních metod detekce a identifikace apoptotických buněk.

Detekční testy

Průtoková cytometrie se nejčastěji používá k detekci fragmentace apoptotické DNA. Analýza obsahu DNA průtokovou cytometrií může identifikovat apoptotické buňky s fragmentovanou DNA jako buňky s frakčním obsahem DNA, často nazývané sub-G1 buňky. Průtoková cytometrická analýza využívající fluorochrom akridinová oranžová ukazuje, že fragmentace DNA v jednotlivých buňkách je diskontinuální, což pravděpodobně odráží různé úrovně omezení v přístupu DNA k DNáze supranukleosomálními a nukleosomálními úrovněmi struktury chromatinu.[15] Přítomnost apoptotické „sub-G1buňky "lze také detekovat v buňkách předem fixovaných v ethanol ale ne po fixaci v síťovacích fixativech, jako je formaldehyd. Pozdní S a G2 apoptotické buňky nemusí být s tímto přístupem detekovány, protože jejich frakční obsah DNA se může překrývat s obsahem apoptotických G1 buňky.[16]Ošetření buněk detergentem, před nebo současně s fluorochromem DNA, také odhaluje fragmentaci DNA na základě přítomnosti sub-G1 buňky nebo fragmenty buněk, jak je definováno v Nicoletti et al.[5]

Apoptotickou fragmentaci DNA lze detekovat také pomocí Test TUNEL. Test TUNEL na bázi fluorochromu použitelný pro průtoková cytometrie, koreluje detekci zlomů řetězců DNA s obsahem buněčné DNA, a tedy s buněčný cyklus -fázová poloha. Test TUNEL pro značení avidin-peroxidázou je použitelný pro mikroskopii absorpce světla. Mnoho sad souvisejících s TUNEL je komerčně dostupných. Apoptotická fragmentace DNA je také analyzována pomocí agaróza gel elektroforéza předvést a „žebříkový“ vzor v intervalech ~ 180 BP.[1] Nekróza Na druhé straně je obvykle charakterizována náhodnou fragmentací DNA, která vytváří „šmouhu“ na agarózových gelech.

Viz také

Reference

  1. ^ Sakahira, H; Enari, M; Nagata, S (leden 1998). "Štěpení inhibitoru CAD při aktivaci CAD a degradaci DNA během apoptózy". Příroda. 391: 96–9. doi:10.1038/34214. PMID  9422513.
  2. ^ A b Wyllie AH (10.04.1980). „Apoptóza thymocytů indukovaná glukokortikoidy je spojena s aktivací endogenní endonukleázy“. Příroda. 284 (5756): 555–556. doi:10.1038 / 284555a0. ISSN  0028-0836. PMID  6245367.
  3. ^ Gorczyca, W; Bruno, S; Darzynkiewicz, R; Gong, J; Darzynkiewicz, Z (listopad 1992). „Přerušení řetězce DNA během apoptózy - jejich včasná detekce insitu terminální deoxynukleotidyltransferázou a testy translace nicků a prevence inhibitory serinproteázy“. Int J Oncol. 1 (6): 639–48. PMID  21584593.
  4. ^ Gavrieli, Y .; Sherman, Y .; Ben-Sasson, S.A. (1992). „Identifikace programované buněčné smrti in situ pomocí specifického značení fragmentace nukleární DNA“. The Journal of Cell Biology. 119 (3): 493–501. doi:10.1083 / jcb.119.3.493. PMC  2289665. PMID  1400587.
  5. ^ Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C (3. června 1991). "Rychlá a jednoduchá metoda pro měření apoptózy thymocytů barvením propidium jodidem a průtokovou cytometrií". Journal of Immunological Methods. 139 (2): 271–279. doi:10.1016 / 0022-1759 (91) 90198-O. PMID  1710634.
  6. ^ Riccardi C, Nicoletti I (9. listopadu 2006). "Analýza apoptózy barvením propidium jodidem a průtokovou cytometrií". Přírodní protokoly. 1 (3): 1458–1461. doi:10.1038 / nprot.2006.238. PMID  17406435.
  7. ^ Nagata, S .; Enari, M .; Sakahira, H .; Yokoyama, H .; Okawa, K .; Iwamatsu, A. (1998). „DNáza aktivovaná kaspázou, která degraduje DNA během apoptózy, a její inhibitor ICAD“. Příroda. 391 (6662): 43–50. doi:10.1038/34112. PMID  9422506.
  8. ^ Williamson, Robert (14.07.1970). "Vlastnosti rychle značených fragmentů deoxyribonukleových kyselin izolovaných z cytoplazmy primárních kultur jaterních buněk embryonálních myší". Journal of Molecular Biology. 51 (1): 157–168. doi:10.1016/0022-2836(70)90277-9. ISSN  0022-2836. PMID  5481278.
  9. ^ A b Kerr, John F. R .; Wyllie, Andrew; Currie, Alastair (srpen 1972). „Apoptóza: základní biologický fenomén s rozsáhlými důsledky pro kinetiku tkáně“. British Journal of Cancer. 26 (4): 239–257. doi:10.1038 / bjc.1972.33. ISSN  0007-0920. PMC  2008650. PMID  4561027.
  10. ^ Burgoyne, Leigh A .; Burgoyne, Leigh A. (1973-05-15). "Chromatinová substruktura. Trávení chromatinové DNA na pravidelně rozmístěných místech jadernou deoxyribonukleázou". Sdělení o biochemickém a biofyzikálním výzkumu. 52 (2): 504–510. doi:10.1016 / 0006-291X (73) 90740-7. ISSN  0006-291X. PMID  4711166.
  11. ^ Williams, Jerry R .; Malý, John B .; Shipley, William U. (1974-12-20). "Sdružení smrti savčích buněk se specifickou endonukleolytickou degradací DNA". Příroda. 252 (5485): 754–755. doi:10.1038 / 252754a0. ISSN  0028-0836. PMID  4474604.
  12. ^ Ceskova, M .; Matyásová, J; Cejková, M (1976-12-31). „DNA v chromatinu ozářených lymfatických tkání se degraduje in vivo do pravidelných fragmentů “. FEBS Dopisy. 72 (2): 271–274. doi:10.1016/0014-5793(76)80984-2. ISSN  0014-5793. PMID  16386038.
  13. ^ Zakharyan, R. A .; Pogosyan, R. G. (1978). „Glukokortikoidy indukují degradaci DNA lymfocytů chromatinu na pravidelně se opakující fragmenty in vivo". Doklady Akademii Nauk Armyanskoi SSR. 67 (2): 110–114. ISSN  0366-8606. CODEN: DANAAW, CAN 90: 115643 AN 1979: 115643 CAPLUS (Copyright 2003 ACS)
  14. ^ Chemical Abstracts v.90,1979; 90: 115643n str.112.
  15. ^ Kajstura, M; Halička, HD; Pryjma, J; Darzynkiewicz, Z (2007). „Diskontinuální fragmentace jaderné DNA během apoptózy odhalená diskrétními„ sub-G1 “vrcholy na histogramech obsahu DNA.“ Cytometrie A. 71: 125–31. doi:10,1002 / cyto.a. 20357. PMID  17252584.
  16. ^ Wlodkowic, D; Telford, W; Skommer, J; Darzynkiewicz, Z (2011). „Apoptóza a další: Cytometrie ve studiích programované buněčné smrti“. Metody Cell Biol. 103: 55–98. doi:10.1016 / B978-0-12-385493-3.00004-8. PMC  3263828. PMID  21722800.

Další čtení

  • Corcoran, G .; Fix, L .; Jones, D. P .; Moslen, M. T .; Nicotera, P .; Oberhammer, F. A .; Buttyan, R. (1994). "Apoptóza: Molekulární kontrolní bod v toxicitě". Toxikologie a aplikovaná farmakologie. 128 (2): 169–181. doi:10.1006 / taap.1994.1195. PMID  7940532.
  • Walker, P. R .; Pandey, S .; Sikorska, M. (1995). "Degradace chromatinu v apoptotických buňkách". Smrt buněk a diferenciace. 2 (2): 97–104. PMID  17180071.
  • Walker, P. R .; Sikorska, M. (1994). "Endonukleázové aktivity, struktura chromatinu a degradace DNA při apoptóze". Biochemie a buněčná biologie. 72 (11–12): 615–623. doi:10.1139 / o94-081. PMID  7654335.
  • Pandey, S .; Walker, P. R .; Sikorska, M. (1994). „Oddělené zásoby aktivity endonukleázy jsou odpovědné za internukleozomální a vysokomolekulární fragmentaci DNA během apoptózy.“ Biochemie a buněčná biologie. 72 (11–12): 625–629. doi:10.1139 / o94-082. PMID  7654336.
  • Muñoz, E .; Marcos, A .; Unzaga, M. T. (1981). "Vliv nedostatku bílkovin na lysozomální enzymové aktivity sleziny a brzlíku odstavených krys". The Journal of Nutrition. 111 (12): 2133–2141. doi:10.1093 / jn / 111.12.2133. PMID  7310538.
  • Varela P, Marcos A, Rey de Viñas JL (1985). "Účinek léčby kortizolem u březích potkanů ​​na buněčný růst potomků". Lékařská věda IRCS. 13: 412–413.