Gramovo barvení - Gram stain - Wikipedia

Gramova skvrna smíšená Zlatý stafylokok (S. aureus ATCC 25923, Grampozitivní koky, fialové) a Escherichia coli (E-coli ATCC 11775, gramnegativní bacily, červeně), nejběžnější referenční bakterie podle Gramova barvení

Gramovo barvení nebo Gramovo barvení, také zvaný Gramova metoda, je metoda barvení slouží k rozlišení a klasifikaci bakteriální druhy do dvou velkých skupin: grampozitivní bakterie a gramnegativní bakterie. Název pochází z dánštiny bakteriolog Hans Christian Gram, který vyvinul techniku.[1]

Gramovo barvení odlišuje bakterie chemickými a fyzikálními vlastnostmi buněčné stěny. Grampozitivní buňky mají silnou vrstvu peptidoglykan v buněčné stěně, která zachovává primární skvrnu, křišťálově fialová. Gramnegativní buňky mají tenčí vrstvu peptidoglykanu, která umožňuje vymytí krystalové violeti po přidání ethanolu. Jsou obarveny růžově nebo červeně kontrastní barva,[2] běžně safranin nebo fuchsin. Lugolův jód po přidání krystalové violeti se vždy přidá roztok, aby se posílily vazby skvrny na buněčnou membránu. Gramovo barvení je téměř vždy prvním krokem v předběžné identifikaci bakteriálního organismu. Zatímco Gramovo barvení je cenným diagnostickým nástrojem v klinickém i výzkumném prostředí, ne všechny bakterie lze touto technikou definitivně klasifikovat. To vede k gram-variabilním a gram-neurčitým skupinám.

Dějiny

Tato metoda je pojmenována po svém vynálezci, dánština vědec Hans Christian Gram (1853–1938), který tuto techniku ​​vyvinul při práci Carl Friedländer v márnici městské nemocnice v Berlín v roce 1884. Gram nevymyslel svou techniku ​​za účelem rozlišení jednoho typu bakterie od druhého, ale aby zviditelnil bakterie ve zabarvených částech plicní tkáně.[3] Svou metodu publikoval v roce 1884 a do své krátké zprávy zahrnul postřeh, že tyfus bacil nezachoval skvrnu.[4]

Použití

Gramovo barvení je a bakteriologické laboratoř technika[5] slouží k rozlišení bakteriální druhy do dvou velkých skupin (grampozitivní a gramnegativní ) na základě jejich fyzikálních vlastností buněčné stěny.[6][stránka potřebná ] Gramovo barvení se při klasifikaci nepoužívá archaea, dříve archaeobakterie, protože tyto mikroorganismy přinášejí velmi rozdílné reakce, které se neřídí jejich fylogenetické skupiny.[7]

Některé organismy jsou gram variabilní (což znamená, že se mohou barvit buď negativně, nebo pozitivně); některé nejsou obarveny žádným barvivem použitým v Gramově technice a nejsou vidět. V moderní environmentální nebo molekulární mikrobiologické laboratoři se většina identifikace provádí pomocí genetických sekvencí a dalších molekulárních technik, které jsou mnohem specifičtější a informativní než rozdílné barvení.

Gramovo barvení bylo navrženo jako stejně účinný diagnostický nástroj jako PCR v jedné zprávě o primárním výzkumu týkající se kapavka.[8][není nutný primární zdroj ]

Lékařský

Viz také: Gramnegativní bakteriální infekce a Grampozitivní bakteriální infekce

Gramovy skvrny se provádějí na tělní tekutina nebo biopsie když infekce je podezřelý. Gramové skvrny poskytují výsledky mnohem rychleji než kultivovat, a jsou obzvláště důležité, pokud by infekce měla významný rozdíl v léčbě a prognóze pacienta; příklady jsou mozkomíšní mok pro meningitida a synoviální tekutina pro septická artritida.[5][9]

Mechanismus barvení

Fialově zbarvené grampozitivní (vlevo) a růžově zbarvené gramnegativní (vpravo)

Grampozitivní bakterie mají silnou síťovitou buněčnou stěnu peptidoglykan (50–90% buněčného obalu), a ve výsledku jsou obarveny fialově krystalově fialovou barvou, zatímco gramnegativní bakterie mají tenčí vrstvu (10% buněčného obalu), takže fialové skvrny nezachovávají a jsou obarveny opačně růžová od safraninu. Existují čtyři základní kroky Gramova barvení:

  • Nanesení primární skvrny (křišťálově fialová ) na tepelně fixovaný nátěr bakteriální kultury. Tepelná fixace zabíjí některé bakterie, ale většinou se používá k připevnění bakterií na sklíčko, aby se během procesu barvení nevypláchly.
  • Přidání jodid, který se váže na krystalickou fialovou a zachycuje ji v buňce
  • Rychlé odbarvení pomocí ethanol nebo aceton
  • Kontrastní barvení s safranin.[10] Carbol fuchsin někdy nahrazuje safranin, protože intenzivněji barví anaerobní bakterie, ale méně často se používá jako kontrastní barva.[11]
Shrnutí Gramova barvení
AplikaceČinidloBarva buňky
GrampozitivníGramnegativní
Primární barvivokřišťálově fialovánachovýnachový
Odchylovací agentjódnachovýnachový
Odbarvovačalkohol /acetonnachovýbezbarvý
Počítadlo skvrnsafranin /carbol fuchsinnachovýrůžový

Křišťálová fialová (CV) disociuje ve vodných roztocích na životopis+
 a chlorid (Cl−
) ionty. Tyto ionty pronikají do buněčné stěny grampozitivních i gramnegativních buněk. The životopis+
 iont interaguje se záporně nabitými složkami bakteriálních buněk a obarví buňky nachově.[12]

Jodid (Já−
 nebo Já−
3) interaguje s životopis+
 a tvoří velké komplexy krystalové violeti a jódu (CV – I) ve vnitřní a vnější vrstvě buňky. Jód se často označuje jako a mořidlo, ale je zachycovacím činidlem, které brání odstranění komplexu CV – I, a proto vybarví buňku.[13]

Když se přidá odbarvovač, jako je alkohol nebo aceton, interaguje s lipidy buněčné membrány.[14] Gramnegativní buňka ztrácí svou vnější lipopolysacharidovou membránu a vnitřní vrstva peptidoglykanu je ponechána odkrytá. Komplexy CV – I jsou vymyty z gramnegativní buňky spolu s vnější membránou.[15] Naproti tomu grampozitivní buňka se dehydratuje působením ethanolu. Velké komplexy CV – I se zachytí v grampozitivní buňce díky vícevrstvé povaze peptidoglykanu.[15] Krok odbarvení je zásadní a musí být správně načasován; pokud je odbarvovací činidlo ponecháno příliš dlouho (během několika sekund), odstraní se krystalová fialová skvrna z grampozitivních i negativních buněk.[16]

Po odbarvení zůstává grampozitivní buňka fialová a gramnegativní buňka ztrácí svou fialovou barvu.[16] Kontrastní barvivo, kterým je obvykle kladně nabitý safranin nebo bazický fuchsin, se nanáší jako poslední, aby odbarvené gramnegativní bakterie získaly růžové nebo červené zbarvení.[2][17] Jak grampozitivní bakterie, tak gramnegativní bakterie vyzvednou kontrastní barvu. Kontrastní barva však na grampozitivních bakteriích není vidět kvůli tmavšímu skvrnu fialové krystaly.

Příklady

Grampozitivní bakterie

Hlavní článek: Grampozitivní bakterie

Grampozitivní bakterie mají obvykle jednu membránu (monoderm) obklopen hustým peptidoglykanem, za tímto pravidlem následují dvě kmeny: Firmicutes (kromě tříd Mollicutes a Negativicutes ) a Aktinobakterie.[6][18] Naproti tomu členové Chloroflexi (zelené nesírové bakterie) jsou monodermy, ale mají slabé nebo žádné (třída Dehalococcoidetes ) peptidoglykan a může barvit negativní, pozitivní nebo neurčitý; členové Deinococcus – Thermus skupina barvení pozitivní, ale jsou didermy se silným peptidoglykanem.[6][stránka potřebná ][18]

Historicky, grampozitivní formy tvořily kmen Firmicutes, název, který se nyní používá pro největší skupinu. Zahrnuje mnoho známých rodů, jako je Lactobacillus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, a Clostridium.[19] Rovněž byl rozšířen o Mollicutes, bakterie, jako jsou Mykoplazma a termoplazma které postrádají buněčné stěny, a proto je nelze obarvit podle Grama, ale jsou odvozeny z takových forem.[20]

Některé bakterie mají buněčné stěny, které jsou zvláště schopné zachytit skvrny. Ty se podle Gramova barvení budou jevit jako pozitivní, i když úzce nesouvisí s jinými grampozitivními bakteriemi. Tito se nazývají kyselinovzdorné bakterie, a lze je odlišit pouze od ostatních grampozitivních bakterií pomocí speciální postupy barvení.[21]

Gramnegativní bakterie

Hlavní článek: Gramnegativní bakterie

Gramnegativní bakterie obecně obsahují tenkou vrstvu peptidoglykanu mezi dvěma membránami (učitelé). Většina bakteriální kmen jsou gramnegativní, včetně sinice, zelené bakterie síry a většina Proteobakterie (s výjimkou některých členů Rickettsiales a hmyzí endosymbionty z Enterobacteriales ).[6][stránka potřebná ][18]

Gram-variabilní a Gram-neurčité bakterie

Některé bakterie, po obarvení Gramovým barvením, dávají gramově proměnný vzor: je vidět směs růžových a fialových buněk.[15][22] V kulturách Bacillus, Butyrivibrio, a Clostridium, snížení tloušťky peptidoglykanu během růstu se shoduje se zvýšením počtu buněk, které se obarví gramnegativně.[22] Navíc u všech bakterií obarvených pomocí Gramova barvení může věk kultury ovlivnit výsledky barvení.[22]

Gram-neurčité bakterie nereagují předvídatelně na Gramovo barvení, a proto je nelze stanovit jako grampozitivní ani gramnegativní. Mezi příklady patří mnoho druhů Mycobacterium, počítaje v to Mycobacterium bovis, Mycobactrium leprae a Mycobacterium tuberculosis, přičemž poslední dva jsou původci malomocenství a tuberkulózy.[23][24]

Pravopisná poznámka

Termín Gramovo barvení je odvozen z příjmení Hans Christian Gram; the eponym (Gram) je tedy psáno velkými písmeny, ale ne běžné podstatné jméno (skvrna), jak je obvyklé pro vědecké termíny.[25] Počáteční písmena grampozitivní a gramnegativní, což jsou stejnojmenná přídavná jména, může být buď kapitál G nebo malá písmena G, podle toho co průvodce stylem (pokud existuje) upravuje psaný dokument. USA používají malý styl Centra pro kontrolu a prevenci nemocí a další stylové režimy, jako je Styl AMA.[26] Slovníky mohou používat malá písmena,[27][28] velká písmena,[29][30][31][32] nebo oboje.[33][34] Velká písmena Grampozitivní nebo Gramnegativní použití je také běžné v mnoha vědecký časopis články a publikace.[34][35][36] Když jsou články zasílány do časopisů, každý časopis může nebo nemusí aplikovat domácí styl na postprint verze. Předtisk verze obsahují jakýkoli styl, který autor náhodou použil. Dokonce i stylové režimy, které u adjektiv používají malá písmena grampozitivní a gramnegativní stále obvykle používají kapitál pro Gramovo barvení.

Viz také

Reference

  1. ^ Colco, R. (2005). "Gramové barvení". Současné protokoly v mikrobiologii. 00 (1): Dodatek 3C. doi:10.1002 / 9780471729259.mca03cs00. ISBN  978-0471729259. PMID  18770544.
  2. ^ A b Beveridge, T. J .; Davies, J. A. (listopad 1983). "Buněčné odpovědi Bacillus subtilis a Escherichia coli na Gramovu skvrnu “. Journal of Bacteriology. 156 (2): 846–58. doi:10.1128 / JB.156.2.846-858.1983. PMC  217903. PMID  6195148.
  3. ^ Austrian, R. (1960). „Gramova skvrna a etiologie lobární pneumonie, historická nota“. Bakteriologické recenze. 24 (3): 261–265. doi:10.1128 / MMBR.24.3.261-265.1960. PMC  441053. PMID  13685217.
  4. ^ Gram, Hans Christian (1884). „Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten“. Fortschritte der Medizin (v němčině). 2: 185–189..
    Anglický překlad v: Brock, T. D. (1999). Milníky v mikrobiologii 1546–1940 (2. vyd.). Stiskněte ASM. 215–218. ISBN  978-1-55581-142-6.
    Překlad je také na: Brock, T. D. „Pioneers in Medical Laboratory Science: Christian Gram 1884“. HOSLink.com. Citováno 27. července 2010.
  5. ^ A b Ryan, K. J .; Ray, C. G., eds. (2004). Sherris Medical Microbiology (4. vydání). McGraw Hill. str. 232f. ISBN  978-0838585290.
  6. ^ A b C d Madigan, M. T .; Martinko, J .; Parker, J. (2004). Brockova biologie mikroorganismů (10. vydání). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN  978-0-13-066271-2.
  7. ^ Beveridge, T. J. (2001). "Použití Gramovy skvrny v mikrobiologii". Biotechnika a histochemie. 76 (3): 111–118. doi:10.1080/714028139. PMID  11475313.
  8. ^ El-Garnal, A. H .; Al-Otaibi, S.R .; Alshamali, A .; Abdulrazzaq, A .; Najem, N .; Fouzan, A. A. (2009). „Polymerázová řetězová reakce není o nic lepší než Gramovo barvení pro diagnostiku gonokokové uretritidy.“ Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 75 (1): 101. doi:10.4103/0378-6323.45243. PMID  19177703.
  9. ^ Søgaard, M .; Nørgaard, M .; Schønheyder, H. (2007). „První oznámení pozitivních krevních kultur: vysoká přesnost zprávy o Gramově barvení“. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4): 1113–1117. doi:10.1128 / JCM.02523-06. PMC  1865800. PMID  17301283.
  10. ^ Black, Jacquelyn G. (1993). Mikrobiologie: Principy a zkoumání. Prentice Hall. str. 65.
  11. ^ „Medical Chemical Corporation“. Med-Chem.com. Citováno 9. března 2016.
  12. ^ Leboffe, Michael (2014). Mikrobiologická laboratorní teorie a aplikace (3. vyd.). Englewood, Colorado: Morton Publishing Company. str. 105. ISBN  978-1617312809.
  13. ^ „Teorie skvrn - Co moridlo není?“. StainsFile.info. Archivovány od originál dne 9. března 2016. Citováno 9. března 2016.
  14. ^ "Gram Stain". Microbugz. Austin Community College. Citováno 2017-05-26.
  15. ^ A b C Tim, Sandle (21. října 2015). Farmaceutická mikrobiologie: Základy zajišťování a kontroly kvality. ISBN  9780081000229. OCLC  923807961.
  16. ^ A b Hardy, Jay; Maria, Santa. "Gram's Serendipitous Stain" (PDF). Hardyho diagnostika.
  17. ^ Davies, J. A .; Anderson, G. K .; Beveridge, T. J .; Clark, H. C. (listopad 1983). „Chemický mechanismus Gramova barvení a syntéza nového elektronově neprůhledného markeru pro elektronovou mikroskopii, který nahrazuje jodové moridlo barviva“. Journal of Bacteriology. 156 (2): 837–845. doi:10.1128 / JB.156.2.837-845.1983. PMC  217902. PMID  6195147.
  18. ^ A b C Brenner, Don J .; Krieg, Noel R .; Staley, James T. (26. července 2005) [1984]. Garrity, George M. (ed.). Úvodní eseje. Bergeyho příručka systematické bakteriologie. 2A (2. vyd.). New York: Springer. str. 304. ISBN  978-0-387-24143-2. Britská knihovna č. GBA561951.
  19. ^ Galperin, Michael Y. (27. prosince 2013). „Rozmanitost genomu firem vytvářejících spory“. Mikrobiologické spektrum. 1 (2). doi:10.1128 / microbiolspectrum.tbs-0015-2012. ISSN  2165-0497. PMC  4306282. PMID  26184964.
  20. ^ Hashem, Hams H. „Praktická lékařská mikrobiologie“. University of Al-Qadisiya.
  21. ^ „Kyselina rychlá skvrna“. www2.Highlands.edu. Georgia Highlands College. Archivovány od originál dne 10. června 2017. Citováno 10. června 2017.
  22. ^ A b C Beveridge, Terry J. (březen 1990). "Mechanismus gramové variability u vybraných bakterií" (PDF). Journal of Bacteriology. 172 (3): 1609–1620. doi:10.1128 / jb.172.3.1609-1620.1990. PMC  208639. PMID  1689718. Citováno 24. ledna 2020.
  23. ^ Black, Jacquelyn (2012). Mikrobiologie: Principy a zkoumání (8. vydání). John Wiley & Sons. str. 68. ISBN  978-0-470-54109-8.
  24. ^ Reynolds, J .; Moyes, R. B .; Breakwell, D. P. (2009). „Dodatek 3“. Diferenciální barvení bakterií: Rychlé kyselé barvení. Současné protokoly v mikrobiologii. Příloha 3. str. H. doi:10.1002 / 9780471729259.mca03hs15. ISBN  978-0471729259. PMID  19885935. S2CID  45685776.
  25. ^ Waddingham, Anne (28. srpna 2014). New Hart's Rules: The Oxford Style Guide. Oxford University Press. str. 105. ISBN  978-0199570027.
  26. ^ „Preferované použití“. Průvodce stylem deníku pro vznikající infekční nemoci. Centra pro kontrolu a prevenci nemocí.
  27. ^ „Ilustrovaný lékařský slovník Dorlanda“ (32. vydání). Elsevier. Citováno 5. června 2020. Použijte hledané výrazy jako gramnegativní.
  28. ^ „gram – pozitivní“, Merriam-Webster.com, Encyklopedie Britannica, Inc.
  29. ^ „Grampozitivní“. CollinsDictionary.com. HarperCollins.
  30. ^ "Gramova skvrna". Lexico.com. Oxford University Press.
  31. ^ „Grampozitivní“. MedicineNet.
  32. ^ „Gram negativní / pozitivní“. BusinessDictionary.com.
  33. ^ „grampozitivní · nebo grampozitivní ·“. The American Heritage Dictionary. Houghton Mifflin.
  34. ^ A b „Grampozitivní“. Dictionary.com.
  35. ^ Brown, Lisa; Vlk, Julie M .; Prados-Rosales, Rafael; Casadevall, Arturo (2015). „Skrz zeď: Extracelulární vezikuly v grampozitivních bakteriích, mykobakteriích a houbách“. Příroda Recenze Mikrobiologie. 13 (10): 620–630. doi:10.1038 / nrmicro3480. PMC  4860279. PMID  26324094.
  36. ^ Mueller, Kristen L. (12. června 2015). "Detekce gramnegativních bakterií". Věda. 348 (6240): 1218. doi:10.1126 / science.348.6240.1218-o.

externí odkazy