Izolace (mikrobiologie) - Isolation (microbiology)

Tento článek má několik problémů. Prosím pomozte vylepši to nebo diskutovat o těchto problémech na internetu diskusní stránka. (Zjistěte, jak a kdy tyto zprávy ze šablony odebrat) tento článek je psán jako osobní reflexe, osobní esej nebo argumentační esej který uvádí osobní pocity editora Wikipedie nebo představuje originální argument o tématu. Prosím pomozte to vylepšit přepsáním do encyklopedický styl. (Leden 2016) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) tento článek případně obsahuje původní výzkum. Prosím vylepši to podle ověřování vznesené nároky a přidání vložené citace. Výroky sestávající pouze z původního výzkumu by měly být odstraněny. (Leden 2016) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) Tento článek obsahuje a seznam doporučení, související čtení nebo externí odkazy, ale jeho zdroje zůstávají nejasné, protože mu chybí vložené citace. Prosím pomozte zlepšit tento článek představuji přesnější citace. (Květen 2019) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony)

V mikrobiologii, termín izolace se týká oddělení kmene od přirozené smíšené živé populace mikroby, jak jsou přítomny v životním prostředí, například ve vodě nebo půdní flóra, nebo od živých bytostí s kožní flóra, orální flóra nebo střevní flóra, v následujících situacích identifikovat mikroby, které nás zajímají. Historicky laboratorní techniky izolace poprvé vyvinuta v oblasti bakteriologie a parazitologie (v průběhu 19. století), před těmi v virologie během 20. století. Metody mikrobiální izolace se za posledních 50 let drasticky změnily, z pohledu práce s rostoucí mechanizací as ohledem na použitou technologii, a tedy i rychlost a přesnost.

Dějiny

The laboratorní techniky izolace mikroby poprvé vyvinut v průběhu 19. století v oblasti bakteriologie a parazitologie použitím světelná mikroskopie. Správné izolační techniky virologie před 20. stoletím neexistovaly. Metody mikrobiální izolace se za posledních 50 let drasticky změnily, z pohledu práce s rostoucí mechanizací as ohledem na použité technologie as ní související rychlost a přesnost.

Obecné techniky

Aby bylo možné izolovat mikrob od přirozené smíšené populace mikroby, jak jsou přítomny v životním prostředí, například ve vodě nebo půdní flóra, nebo od živých bytostí s kožní flóra, orální flóra nebo střevní flóra je třeba jej oddělit od mixu.

Tradičně byly mikroby kultivovaný v následujících situacích identifikovat mikrob (y) zájmu na základě jeho růstových charakteristik. V závislosti na očekávané hustotě a životaschopnosti mikrobů přítomných v kapalném vzorku, například fyzikální metody pro zvýšení gradientu sériové ředění nebo centrifugace Aby bylo možné izolovat organismy v materiálech s vysokým mikrobiálním obsahem, jako jsou odpadní vody, půda nebo stolice, zvýší sériové ředění šanci na oddělení směsi.

V kapalném médiu s několika nebo žádnými očekávanými organismy z oblasti, která je normálně sterilní (např Mozkomíšní mozek, krev uvnitř oběhového systému), centrifugace, dekantace supernatantu a použití pouze sedimentu zvýší šanci na růst a izolaci bakterií nebo obvykle virů spojených s buňkami.

Pokud člověk očekává nebo hledá zvlášť náročný organismus, mikrobiologická kultura a izolační techniky budou muset být zaměřeny na toho mikroba. Například bakterie, která zahyne při vystavení vzduchu, lze izolovat, pouze pokud je vzorek nesen a zpracován za bezvzduchových nebo anaerobních podmínek. Bakterie, která zemře, když je vystavena pokojové teplotě (termofilní), vyžaduje předehřátou přepravní nádobu a mikrob, který uschne a zemře, když je přepravován na vatovém tamponu, bude před úspěšnou kultivací potřebovat virové transportní médium.

Bakteriální a houbová kultura

Očkování

Laboratorní technici naočkovat vzorek na určitou pevnou látku agarové desky s metoda pruhové desky nebo do kapaliny kultivační médium, podle toho, co je cílem izolace:

• Pokud někdo chce izolovat pouze konkrétní skupina bakterií, jako např Skupina A Streptococcus z výtěru z krku lze použít a selektivní médium které potlačují růst doprovodných bakterií očekávaných ve směsi (antibiotiky přítomnými v agaru), takže jsou „vybrány“ pouze streptokoky, tj. viditelně vyniknout. Izolovat houby, Sabouraudův agar může být použito. Alternativně jsou letální podmínky pro streptokoky a gramnegativní bakterie podobné sůl koncentrace v Mannitolový solný agar upřednostňovat přežití každého stafylokoky přítomna ve vzorku střevních bakterií a fenolová červeň v agaru působí jako a indikátor ph což ukazuje, zda jsou bakterie schopné fermentovat mannitol vylučováním kyseliny do média. V jiných agarových látkách se přidávají látky k využití schopnosti organismu produkovat viditelný pigment (např. granada medium pro Skupina B Streptococcus ) který mění bakteriální kolonie nebo rozpustit krevní agar podle hemolýza aby je bylo možné snáze spatřit. Některé bakterie mají rádi Druhy legionel vyžadují zvláštní živiny nebo vázání toxinů jako v dřevěné uhlí růst, a proto média jako Agar s kvasinkovým extraktem z pufrovaného uhlí musí být použito.
• Pokud se někdo chce izolovat tolik nebo všechny možné kmeny, různá živná média i obohacená média, jako např krevní agar a čokoládový agar a anaerobní kultivační média jako thioglykolátový vývar je třeba naočkovat. Chcete-li vyjmenovat růst, mohou být bakterie suspendovány v roztaveném agaru, než ztuhnou, a poté nality do Petriho misky, takzvaná metoda „pour plate“, která se používá v mikrobiologie životního prostředí a potravinářská mikrobiologie (např. testování mléčných výrobků) za účelem stanovení takzvaného `` počtu aerobních destiček``.

Inkubace

Poté, co je vzorek naočkován do nebo na zvolené médium, jsou inkubováno za vhodných atmosférických podmínek, jako je aerobní, anaerobní nebo mikroaerofilní podmínek nebo s přidaným oxidem uhličitým (5%), při různých nastaveních teploty, například 37 ° C v an inkubátor nebo v lednici na obohacování za studena, za vhodného světla, například přísně bez světla zabaleného v papíru nebo v tmavé láhvi pro skotochromogen mykobakterie a různě dlouhou dobu, protože různé bakterie rostou jinou rychlostí, která se liší od hodin (Escherichia coli ) až týdny (např.mykobakterie ).

V pravidelných, sériových intervalech laboratorní technici a mikrobiologové zkontrolujte média na známky viditelného růstu a zaznamenejte to. K inspekci musí znovu dojít za podmínek upřednostňujících přežití izolátu, tj. Například v „anaerobní komoře“ pro anaerobní bakterie, a za podmínek, které neohrožují osobu, která se dívá na destičky, před infikováním zvláště infekčním mikrobem, tj. Za A biologická bezpečnostní skříň pro Yersinia pestis (mor) nebo Bacillus anthracis (antrax) například.

Identifikace

Když bakterie viditelně rostou, jsou často stále smíšené. Identifikace mikroba závisí na izolaci jedince kolonie, protože biochemické testování mikroba k určení jeho různých fyziologických vlastností závisí na a čistá kultura.Vyrobit subkultůra, jeden zase pracuje aseptická technika v mikrobiologii, zvednutím jedné kolonie z povrchu agaru pomocí smyčky a pruhy materiálu do 4 kvadrantů agarové desky nebo do celého, pokud byla kolonie singulární a nevypadala smíšeně.

Gramovo barvení surový vzorek před inkubací nebo barvením čerstvě vypěstovaného materiálu kolonií pomáhá určit, zda kolonie sestává z rovnoměrně se objevujících bakterií nebo je smíchána, a barva a tvar bakterií umožňují první klasifikaci na základě morfologie. V klinické mikrobiologii se používá řada dalších technik barvení pro konkrétní organismy (kyselé rychlé bakteriální barvení pro mykobakterie). Imunologické barvicí techniky, jako např přímá imunofluorescence byly vyvinuty pro lékařsky důležité patogeny které pomalu rostou (Skvrna Auramin-rhodamin pro mykobakterie) nebo obtížně pěstovatelné (např. druhy Legionella pneumophila) a kde by výsledek testu změnil standardní management a empirická terapie.

Biochemické testování bakterií zahrnuje sadu agarů v lahvičkách, které oddělují pohyblivost od nepohyblivé bakterie V roce 1970 byla vyvinuta miniaturizovaná verze s názvem index analytického profilu.

Úspěšná identifikace např. sekvenování genomu a genomika záleží na čistých kulturách.

Bakterie, nezávislé na kultuře

Nejrychlejší metodou identifikace bakterií je jejich sekvenování 16S rRNA gen, který byl PCR-amplifikováno předem tato metoda nevyžaduje izolaci. Protože většinu bakterií nelze pěstovat konvenčními metodami (zejména bakteriemi v prostředí nebo v půdě) metagenomika nebo metatranscriptomics Jsou používány, sekvenování brokovnice nebo PCR sekvenování genomu. Sekvenování pomocí hmotnostní spektrometrie jako v Maticová laserová desorpce / ionizace (MALDI-TOF MS) se používá při analýze klinických vzorků k hledání patogenů. Sekvenování celého genomu je možnost pro singulární organismus, který nelze dostatečně charakterizovat pro identifikaci. Malý DNA mikročipy lze také použít k identifikaci.

Reference

Příručka k mikrobiologické aplikaci Benson 8. vydání