RNA-sekv - RNA-Seq

Souhrn RNA-Seq. V organismu jsou geny transkribovány a (v an eukaryotický organismus ) sestříhané, aby se vytvořily zralé přepisy mRNA (červené). MRNA je extrahována z organismu, fragmentována a kopírována do stabilní ds-cDNA (modrá). Ds-cDNA se sekvenuje za použití vysoká propustnost, metody sekvenování krátkého čtení. Tyto sekvence pak mohou být zarovnaný k referenční sekvenci genomu k rekonstrukci, které oblasti genomu byly přepsány. Tato data lze použít k anotaci, kde jsou exprimované geny, jejich relativní úrovně exprese a jakékoli alternativní varianty sestřihu.[1]

RNA-sekv (pojmenovaný jako zkratka „sekvenování RNA“) je založen na konkrétní technologii sekvenování technika, která používá sekvenování nové generace (NGS) odhalit přítomnost a množství RNA v biologickém vzorku v daném okamžiku a analyzuje neustále se měnící buněčnou přepis.[2][3]

Konkrétně RNA-Seq usnadňuje schopnost dívat se na alternativní genové sestřihové transkripty, post-transkripční úpravy, genová fúze mutace /SNP a změny v genové expresi v průběhu času, nebo rozdíly v genové expresi v různých skupinách nebo léčbě.[4] Kromě transkriptů mRNA může RNA-Seq sledovat různé populace RNA, aby zahrnovala celkovou RNA, malou RNA, jako je miRNA, tRNA, a ribozomální profilování.[5] K určení lze také použít RNA-Seq exon /intron hranice a dříve ověřit nebo změnit anotováno 5' a 3' hranice genů. Mezi nedávné pokroky v RNA-Seq patří sekvenování jedné buňky a in situ sekvenování fixované tkáně.[6]

Před RNA-Seq byly studie genové exprese prováděny na základě hybridizace mikročipy. Problémy s mikročipy zahrnují artefakty křížové hybridizace, špatná kvantifikace nízko a vysoce exprimovaných genů a potřeba znát sekvenci a priori.[7] Kvůli těmto technickým problémům transkriptomika převedeny na metody založené na sekvenování. Ty postupovaly od Sangerovo sekvenování z Expresní značka sekvence knihovny, na metody založené na chemických značkách (např. sériová analýza genové exprese ) a konečně k současné technologii, sekvenování nové generace z cDNA (zejména RNA-Seq).

Metody

Příprava knihovny

Viz také: Knihovna (biologie)
Přehled typického experimentálního pracovního postupu RNA-Seq.[8]

Obecné kroky k přípravě a komplementární DNA (cDNA) knihovna pro sekvenování jsou popsány níže, ale často se liší mezi platformami.[8][3][9]

  1. Izolace RNA: RNA je izolována z tkáně a smíchané s deoxyribonukleáza (DNáza). DNáza snižuje množství genomové DNA. Míra degradace RNA se kontroluje pomocí gel a kapilární elektroforéza a slouží k přiřazení Číslo integrity RNA na vzorek. Tato kvalita RNA a celkové množství výchozí RNA se bere v úvahu během následujících kroků přípravy knihovny, sekvenování a analýzy.
  2. Výběr / vyčerpání RNA: K analýze sledovaných signálů může být izolovaná RNA buď uchována tak, jak je, zbavena ribozomální RNA (rRNA), filtrováno na RNA pomocí 3 'polyadenylovaný (poly (A)) ocasy pouze zahrnout mRNA a / nebo filtrovány na RNA, která váže specifické sekvence (Metody selekce a deplece RNA tabulka níže). U eukaryot je RNA s 3 'poly (A) ocasy zralé, zpracované, kódující sekvence. Poly (A) selekce se provádí smícháním eukaryotické RNA s poly (T) oligomery kovalentně připojenými k substrátu, typicky magnetickým kuličkám.[10][11] Výběr Poly (A) ignoruje nekódující RNA a zavádí zkreslení 3 ',[12] kterému se při strategii vyčerpání ribozomů vyhneme. RRNA je odstraněna, protože představuje více než 90% RNA v buňce, která, pokud by byla uchována, utopila by další data v transkriptomu.
  3. cDNA syntéza: RNA je zpětně přepsaný k cDNA, protože DNA je stabilnější a umožňuje amplifikaci (což využívá DNA polymerázy ) a využít vyspělejší technologii sekvenování DNA. Zesílení po reverzní transkripci vede ke ztrátě uvíznutí, kterému se lze vyhnout chemickým značením nebo sekvenováním jedné molekuly. Fragmentace a výběr velikosti se provádí za účelem čištění sekvencí, které jsou vhodné délky pro sekvenční stroj. RNA, cDNA nebo obě jsou fragmentovány enzymy, sonikace nebo nebulizéry. Fragmentace RNA snižuje zkreslení 5 'náhodně aktivované reverzní transkripce a vliv primer vazebná místa,[11] s nevýhodou, že 5 'a 3' konce jsou konvertovány na DNA méně efektivně. Po fragmentaci následuje výběr velikosti, kde jsou odstraněny buď malé sekvence, nebo je vybrán úzký rozsah délek sekvencí. Protože malé RNA mají rádi miRNA jsou ztraceny, jsou analyzovány samostatně. CDNA pro každý experiment může být indexována pomocí hexamerového nebo oktamerového čárového kódu, takže tyto experimenty mohou být sloučeny do jednoho pruhu pro multiplexované sekvenování.
Metody výběru a deplece RNA:[8]
StrategieTyp RNAObsah ribozomální RNANezpracovaný obsah RNAObsah genomové DNAIzolační metoda
Celková RNAVšechnoVysokýVysokýVysokýŽádný
Výběr PolyAKódováníNízkýNízkýNízkýHybridizace s poly (dT) oligomery
Vyčerpání rRNAKódování, nekódováníNízkýVysokýVysokýOdstranění oligomerů komplementárních k rRNA
Zachycení RNACílenéNízkýMírnýNízkýHybridizace se sondami doplňujícími požadované transkripty

Malé sekvenování RNA / nekódující RNA

Při sekvenování jiné RNA než mRNA se modifikuje příprava knihovny. Buněčná RNA je vybrána na základě požadovaného rozsahu velikosti. Pro malé cíle RNA, jako je miRNA, je RNA izolována výběrem velikosti. To lze provést pomocí gelu vylučujícího velikost, pomocí magnetických kuliček pro výběr velikosti nebo pomocí komerčně vyvinuté soupravy. Jakmile jsou izolovány, jsou linkery přidány na 3 'a 5' konec a poté purifikovány. Posledním krokem je cDNA generace prostřednictvím reverzní transkripce.

Přímé sekvenování RNA

RNASeqPics1.jpg
RNASeqPics2.jpg

Protože přeměňuje RNA na cDNA Bylo prokázáno, že ligace, amplifikace a další manipulace se vzorky zavádějí předsudky a artefakty, které mohou interferovat se správnou charakterizací i kvantifikací transkriptů,[13] společnosti zahrnující přímé sekvenování jedné molekuly RNA Helicos (úpadce), Oxford Nanopore Technologies,[14] a další. Tato technologie sekvenuje molekuly RNA přímo masivně paralelně.

Sekvenování jednobuněčné RNA (scRNA-Seq)

Viz také: Sekvenování jednotlivých buněk

Standardní metody jako např mikročipy a standardní hromadná analýza RNA-Seq analyzuje expresi RNA z velkých populací buněk. Ve smíšených populacích buněk mohou tato měření zakrýt kritické rozdíly mezi jednotlivými buňkami v těchto populacích.[15][16]

Sekvenování jednobuněčné RNA (scRNA-Seq) poskytuje profily výrazů jednotlivých buněk. Ačkoli není možné získat úplné informace o každé RNA exprimované každou buňkou, vzhledem k malému množství dostupného materiálu lze vzorce genové exprese identifikovat pomocí genu shlukové analýzy. To může odhalit existenci vzácných typů buněk v buněčné populaci, které nikdy předtím nebyly vidět. Například zvané vzácné specializované buňky v plicích plicní ionocyty které vyjadřují Regulátor transmembránové vodivosti cystické fibrózy byly identifikovány v roce 2018 dvěma skupinami provádějícími scRNA-Seq na epitelu dýchacích cest.[17][18]

Experimentální postupy

Pracovní postup sekvenování jednobuněčné RNA

Současné protokoly scRNA-Seq zahrnují následující kroky: izolace jedné buňky a RNA, reverzní transkripce (RT), amplifikace, generování knihovny a sekvenování. První metody rozdělily jednotlivé buňky do samostatných jamek; novější metody zapouzdřují jednotlivé buňky v kapičkách v mikrofluidním zařízení, kde probíhá reverzní transkripční reakce, převádějící RNA na cDNA. Každá kapička nese DNA "čárový kód", který jedinečně označuje cDNA odvozené z jedné buňky. Jakmile je reverzní transkripce dokončena, mohou být cDNA z mnoha buněk smíchány dohromady pro sekvenování; přepisy z konkrétní buňky jsou identifikovány jedinečným čárovým kódem.[19][20]

Výzvy pro scRNA-Seq zahrnují zachování počátečního relativního množství mRNA v buňce a identifikaci vzácných transkriptů.[21] Krok reverzní transkripce je kritický, protože účinnost RT reakce určuje, kolik populace RNA buňky bude nakonec analyzováno sekvencerem. Procesivita reverzních transkriptáz a použité primární strategie mohou ovlivnit produkci cDNA v plné délce a generování knihoven předpojatých ke 3 'nebo 5' konci genů.

V kroku amplifikace buď PCR nebo in vitro transkripce (IVT) se v současné době používá k amplifikaci cDNA. Jednou z výhod metod založených na PCR je schopnost generovat cDNA plné délky. Různá účinnost PCR na konkrétních sekvencích (například obsah GC a struktura snapbacku) však může být také exponenciálně amplifikována, což vytváří knihovny s nerovnoměrným pokrytím. Na druhou stranu, zatímco knihovny generované IVT se mohou vyhnout zkreslení sekvencí vyvolaných PCR, specifické sekvence mohou být přepsány neefektivně, což způsobí výpadek sekvence nebo generování neúplných sekvencí.[22][15]Bylo publikováno několik protokolů scRNA-Seq: Tang et al.,[23]STRT,[24]SMART-seq,[25]CEL-seq,[26]RAGE-seq,[27], Quartz-seq.[28]a C1-CAGE.[29] Tyto protokoly se liší, pokud jde o strategie pro reverzní transkripci, syntézu a amplifikaci cDNA, a možnost přizpůsobit čárové kódy specifické pro sekvenci (tj. UMI ) nebo schopnost zpracovávat shromážděné vzorky.[30]

V roce 2017 byly zavedeny dva přístupy k současnému měření jednobuněčné exprese mRNA a proteinu prostřednictvím protilátek značených oligonukleotidy známých jako REAP-seq,[31] a CITE-seq.[32]

Aplikace

scRNA-Seq se stává široce používaným napříč biologickými disciplínami včetně vývoje, Neurologie,[33] Onkologie,[34][35][36] Autoimunitní onemocnění,[37] a Infekční nemoc.[38]

scRNA-Seq poskytl značný pohled na vývoj embryí a organismů, včetně červa Caenorhabditis elegans,[39] a regenerativní planar Schmidtea mediterranea.[40][41] První obratlovci, kteří byli takto mapováni, byli Zebrafish[42][43] a Xenopus laevis.[44] V každém případě bylo studováno několik stadií embrya, což umožnilo mapovat celý proces vývoje na bázi buňka po buňce.[8] Věda uznal tyto zálohy jako rok 2018 Průlom roku.[45]

Experimentální úvahy

Různé parametry jsou brány v úvahu při navrhování a provádění experimentů RNA-Seq:

  • Specifičnost tkáně: Genová exprese se liší uvnitř a mezi tkáněmi a RNA-Seq měří tuto kombinaci buněčných typů. To může ztěžovat izolaci sledovaného biologického mechanismu. Sekvenování jednotlivých buněk lze použít ke studiu každé buňky samostatně, zmírnění tohoto problému.
  • Časová závislost: Genová exprese se časem mění a RNA-Seq pořídí pouze snímek. Pro sledování změn v transkriptomu lze provádět experimenty s časovým průběhem.
  • Pokrytí (také známé jako hloubka): RNA obsahuje stejné mutace pozorované v DNA a detekce vyžaduje hlubší pokrytí. S dostatečně vysokým pokrytím lze použít RNA-Seq k odhadu exprese každé alely. To může poskytnout vhled do jevů, jako jsou potisk nebo cis-regulační účinky. Hloubku sekvenování požadovanou pro konkrétní aplikace lze extrapolovat z pilotního experimentu.[46]
  • Artefakty generování dat (známé také jako technická odchylka): Činidla (např. Souprava pro přípravu knihovny), zapojený personál a typ sekvenceru (např. Illumina, Pacific Biosciences ) může vést k technickým artefaktům, které mohou být nesprávně interpretovány jako smysluplné výsledky. Stejně jako u jiných vědeckých experimentů je rozumné provádět RNA-Seq v dobře kontrolovaném prostředí. Pokud to není možné nebo je studie a metaanalýza, dalším řešením je detekovat technické artefakty odvozením latentní proměnné (typicky analýza hlavních komponent nebo faktorová analýza ) a následnou korekci těchto proměnných.[47]
  • Správa dat: Jeden experiment RNA-Seq u lidí je obvykle v řádu 1 GB.[48] Tento velký objem dat může představovat problémy s úložištěm. Jedno řešení je komprese data pomocí víceúčelových výpočetních schémat (např. gzip ) nebo schémata specifická pro genomiku. Ten může být založen na referenčních sekvencích nebo de novo. Dalším řešením je provádět experimenty s mikročipy, které mohou být dostatečné pro práci založenou na hypotézách nebo replikační studie (na rozdíl od průzkumného výzkumu).

Analýza

Viz také: Seznam nástrojů pro bioinformatiku RNA-Seq
Schéma popisující analýzy RNA-Seq popsané v této části

Sestava transkriptomu

Viz také: Software pro zarovnání sekvence § Zarovnání sekvence krátkého čtení

K přiřazení nezpracovaných sekvenčních čtení genomickým znakům (tj. Sestavení transkriptomu) se používají dvě metody:

  • De novo: Tento přístup nevyžaduje a referenční genom rekonstruovat transkriptom a obvykle se používá, pokud je genom ve srovnání s referencí neznámý, neúplný nebo podstatně pozměněný.[49] Výzvy při použití krátkých čtení pro sestavu de novo zahrnují 1) určení, která čtení by měla být spojena do souvislých sekvencí (kontigy ), 2) robustnost vůči sekvenčním chybám a dalším artefaktům a 3) výpočetní účinnost. Primární algoritmus použitý pro sestavu de novo přešel z překrývajících se grafů, které identifikují všechna párová překrytí mezi čteními, na de Bruijn grafy, který rozdělí čte do sekvencí délky k a sbalí všechny k-mery do hash tabulky.[50] Překrývající se grafy byly použity se Sangerovým sekvenováním, ale neomezují se dobře na miliony čtení generovaných pomocí RNA-Seq. Příklady assemblerů, které používají grafy de Bruijn, jsou Samet,[51] Trojice,[49] Oázy,[52] a Bridger.[53] Spárovaný konec a dlouhé sekvenční čtení stejného vzorku mohou zmírnit deficity v krátkém sekvenčním čtení tím, že slouží jako šablona nebo kostra. Metriky pro hodnocení kvality sestavy de novo zahrnují střední délku kontig, počet kontig a N50.[54]
Mapování RNA-Seq krátkých čtení v křižovatkách exon-exon. Konečná mRNA je sekvenována, v níž chybí intronové části pre-mRNA.
  • Vedený genom: Tento přístup se opírá o stejné metody, které se používají pro zarovnání DNA, s další složitostí srovnávání čtení, která pokrývají nekontinuální části referenčního genomu.[55] Tato nekontinuální čtení jsou výsledkem sekvenování sestřižených přepisů (viz obrázek). Algoritmy zarovnání mají obvykle dva kroky: 1) zarovnání krátkých částí čtení (tj. Naočkování genomu) a 2) použití dynamické programování najít optimální zarovnání, někdy v kombinaci se známými anotacemi. Softwarové nástroje, které používají zarovnání vedené genomem, zahrnují Bowtie,[56] TopHat (který staví na výsledcích BowTie k zarovnání spojů spojení),[57][58] Subread,[59] HVĚZDA,[55] HISAT2,[60] Plachetník,[61] Kallisto,[62] a GMAP.[63] Kvalitu sestavy vedené genomem lze měřit jak 1) metrikami sestavy de novo (např. N50), tak 2) srovnáním se známými transkripty, spojovacími spoji, genomem a proteinovými sekvencemi pomocí přesnost, odvolání nebo jejich kombinace (např. skóre F1).[54] Navíc, in silico hodnocení lze provést pomocí simulovaných čtení.[64][65]

Poznámka ke kvalitě montáže: Současná shoda je v tom, že 1) kvalita sestavy se může lišit v závislosti na použité metrice, 2) sestavy, které dosáhly dobrého skóre u jednoho druhu, nemusí nutně dobře fungovat u ostatních druhů a 3) kombinace nejrůznějších přístupů může být nejspolehlivější.[66][67]

Kvantifikace genové exprese

Exprese je kvantifikována pro studium buněčných změn v reakci na vnější podněty, rozdíly mezi zdravými a nemocný státy a další výzkumné otázky. Genová exprese se často používá jako proxy pro hojnost proteinů, ale často nejsou ekvivalentní kvůli post transkripčním událostem, jako je Interference RNA a nesmysl zprostředkovaný úpadek.[68]

Výraz je kvantifikován počítáním počtu čtení, která byla namapována na každý lokus v transkriptomová sestava krok. Exprese může být kvantifikována pro exony nebo geny pomocí kontigů nebo anotací referenčních transkriptů.[8] Tyto pozorované počty čtení RNA-Seq byly důkladně ověřeny oproti starším technologiím, včetně expresních mikročipů a qPCR.[46][69] Příklady nástrojů, které kvantifikují počty, jsou HTSeq,[70] FeatureCounts,[71] Rcount,[72] maximální počet účtů,[73] FIXSEQ,[74] a Cuffquant. Počty čtení jsou poté převedeny do příslušných metrik pro testování hypotéz, regrese a další analýzy. Parametry pro tento převod jsou:

  • Hloubka / pokrytí sekvence: I když je hloubka při provádění několika experimentů RNA-Seq předem specifikována, bude se mezi experimenty stále značně lišit.[75] Proto je celkový počet čtení generovaných v jednom experimentu obvykle normalizován převedením počtů na fragmenty, čtení nebo počty na milion mapovaných čtení (FPM, RPM nebo CPM). Hloubka sekvenování se někdy označuje jako velikost knihovny, počet zprostředkujících molekul cDNA v experimentu.
  • Délka genu: Delší geny budou mít více fragmentů / čtení / počtů než kratší geny, pokud je transkripční exprese stejná. To je upraveno dělením FPM délkou genu, což vede k metrickým fragmentům na kilobázi přepisu na milion mapovaných čtení (FPKM).[76] Při pohledu na skupiny genů napříč vzorky se FPKM převádí na transkripty na milion (TPM) dělením každého FPKM součtem FPKM ve vzorku.[77][78][79]
  • Celkový výstup RNA: Protože se z každého vzorku extrahuje stejné množství RNA, vzorky s více celkovou RNA budou mít méně RNA na gen. Zdá se, že tyto geny mají sníženou expresi, což vede k falešným pozitivům v následných analýzách.[75] Normalizační strategie zahrnující kvantil, DESeq2, TMM a Median Ratio se pokoušejí vysvětlit tento rozdíl porovnáním sady nediferenčně exprimovaných genů mezi vzorky a odpovídajícím měřítkem.[80]
  • Rozptyl pro expresi každého genu: je vytvořen tak, aby odpovídal chyba vzorkování (důležité pro geny s nízkým počtem čtení), zvýšit sílu a snížit falešně pozitivní výsledky. Rozptyl lze odhadnout jako a normální, jed nebo negativní binomický rozdělení[81][82][83] a často se rozkládá na technickou a biologickou odchylku.

Absolutní kvantifikace

Absolutní kvantifikace genové exprese není možná u většiny experimentů RNA-Seq, které kvantifikují expresi vzhledem ke všem transkriptům. Je to možné provedením RNA-Seq se špičkami, vzorky RNA při známých koncentracích. Po sekvenování se počty načtení spike-in sekvencí použijí ke stanovení vztahu mezi počty načtení každého genu a absolutním množstvím biologických fragmentů.[11][84] V jednom příkladu byla tato technika použita v Xenopus tropicalis embrya k určení kinetiky transkripce.[85]

Diferenciální výraz

Nejjednodušším, ale často nejsilnějším využitím RNA-Seq je nalezení rozdílů v genové expresi mezi dvěma nebo více podmínkami (např., léčeno vs. neléčeno); tento proces se nazývá diferenciální výraz. Výstupy jsou často označovány jako odlišně exprimované geny (DEG) a tyto geny mohou být buď regulovány nahoru nebo dolů (tj., vyšší nebo nižší v podmínce zájmu). Je jich mnoho nástroje, které provádějí diferenciální výraz. Většina z nich je spuštěna R, Krajta, nebo Unix příkazový řádek. Mezi běžně používané nástroje patří DESeq,[82] edgeR,[83] a voom + limma,[81][86] všechny jsou k dispozici prostřednictvím R /Biovodič.[87][88] Při provádění rozdílového výrazu jsou běžné úvahy:

  • Vstupy: Diferenciální vstupy exprese zahrnují (1) RNA-Seq expresní matici (M geny x N vzorky) a (2) a návrhová matice obsahující experimentální podmínky pro N vzorků. Nejjednodušší návrhová matice obsahuje jeden sloupec, který odpovídá štítkům testované podmínky. Mohou zahrnovat i další proměnné (označované také jako faktory, vlastnosti, štítky nebo parametry) dávkové efekty, známé artefakty a veškerá metadata, která by mohla zmást nebo zprostředkovat genovou expresi. Kromě známých kovariát je možné odhadnout také neznámé kovariáty strojové učení bez dozoru přístupy včetně hlavní složka, náhradní proměnná,[89] a PEER[47] analýzy. Skryté analýzy proměnných se často používají pro data RNA lidské sekvence tkáně, která obvykle obsahují další artefakty nezachycené v metadatech (např., ischemický čas, získávání z více institucí, základní klinické vlastnosti, shromažďování údajů po mnoho let s mnoha zaměstnanci).
  • Metody: Většina nástrojů používá regrese nebo neparametrické statistiky identifikovat odlišně exprimované geny a jsou buď založené na počtu (DESeq2, limma, edgeR) nebo na základě sestavení (prostřednictvím kvantifikace bez zarovnání, sleuth,[90] Cuffdiff,[91] Plesové šaty[92]).[93] Po regresi většina nástrojů využívá buď rodinná chybovost (FWER) nebo míra falešných objevů (FDR) p-hodnota úpravy na účet více hypotéz (ve studiích na lidech ~ 20 000 genů kódujících proteiny nebo ~ 50 000 biotypů).
  • Výstupy: Typický výstup se skládá z řádků odpovídajících počtu genů a alespoň tří sloupců, protokol každého genu složit změnu (log-transformace poměru ve vyjádření mezi podmínkami, míra velikost efektu ), p-hodnota a hodnota p upravená pro více srovnání. Geny jsou definovány jako biologicky smysluplné, pokud projdou mezními hodnotami pro velikost účinku (změna logaritmického záhybu) a statistická významnost. Tyto mezní hodnoty by měly být v ideálním případě specifikovány a priori, ale podstata experimentů RNA-Seq je často průzkumná, takže je obtížné předvídat velikosti účinku a příslušné mezní hodnoty předem.
  • Úskalí: Raison d'etre těchto složitých metod je vyhnout se nesčetným nástrahám, které mohou vést statistické chyby a zavádějící interpretace. Mezi úskalí patří zvýšená míra falešně pozitivních výsledků (kvůli vícenásobnému srovnání), artefakty přípravy vzorků, heterogenita vzorků (jako smíšené genetické pozadí), vysoce korelované vzorky, nezohledněné víceúrovňové experimentální návrhy a chudý experimentální design. Jedním pozoruhodným úskalím je prohlížení výsledků v aplikaci Microsoft Excel bez použití funkce importu, která zajistí, že názvy genů zůstanou textem.[94] Ačkoli je to vhodné, Excel automaticky převádí některé názvy genů (SEPT1, DEC1, 2. BŘEZNA ) do dat nebo čísel s plovoucí desetinnou čárkou.
  • Výběr nástrojů a benchmarking: Existuje mnoho snah, které srovnávají výsledky těchto nástrojů, přičemž DESeq2 má tendenci mírně překonávat jiné metody.[95][96][97][98][99][93][100] Stejně jako u jiných metod spočívá benchmarking ve vzájemném porovnání výstupů nástroje a známých zlaté standardy.

Následné analýzy seznamu odlišně exprimovaných genů přicházejí ve dvou příchutích, což potvrzuje pozorování a vytváří biologické závěry. Vzhledem k úskalím diferenciální exprese a RNA-Seq jsou důležitá pozorování replikována (1) ortogonální metodou ve stejných vzorcích (jako real-time PCR ) nebo (2) někdy jiný předregistrováno, experimentujte v nové kohortě. Ten pomáhá zajistit zobecnitelnost a lze jej obvykle sledovat metaanalýzou všech sdružených kohort. Nejběžnější metodou pro získání biologického porozumění výsledků na vyšší úrovni je analýza obohacení genové sady, i když se někdy používají přístupy kandidátských genů. Obohatení sady genů určuje, zda je překrytí mezi dvěma sadami genů statisticky významné, v tomto případě překrytí rozdílně exprimovaných genů a sad genů ze známých cest / databází (např., Genová ontologie, KEGG, Lidská fenotypová ontologie ) nebo z doplňkových analýz ve stejných datech (jako jsou sítě pro společné vyjádření). Mezi běžné nástroje pro obohacování genové sady patří webová rozhraní (např., ENRICHR, g: profiler) a softwarové balíčky. Při hodnocení výsledků obohacování je jednou heuristikou nejprve hledat obohacení známé biologie jako kontrolu zdravého rozumu a poté rozšířit rozsah tak, aby hledal novou biologii.

Alternativní typy událostí sestřihu RNA. Exony jsou reprezentovány jako modré a žluté bloky, introny jako čáry mezi nimi.

Alternativní sestřih

Sestřih RNA je nedílnou součástí eukaryot a významně přispívá k regulaci a rozmanitosti proteinů, vyskytující se u> 90% lidských genů.[101] Existuje několik alternativní režimy sestřihu: přeskočení exonu (nejběžnější způsob sestřihu u lidí a vyšších eukaryot), vzájemně se vylučující exony, alternativní donorová nebo akceptorová místa, retence intronu (nejběžnější způsob sestřihu u rostlin, hub a prvoků), alternativní místo zahájení transkripce (promotor) a alternativní polyadenylace.[101] Jedním z cílů RNA-Seq je identifikovat alternativní sestřihové události a otestovat, zda se liší mezi podmínkami. Sekvenování s dlouhým čtením zachycuje celý přepis a minimalizuje tak mnoho problémů při odhadování četnosti izoforem, jako je nejednoznačné mapování čtení. Pro krátké čtení RNA-Seq existuje několik metod k detekci alternativního sestřihu, které lze rozdělit do tří hlavních skupin:[102][103][104]

  • Na základě počtu (také na základě událostí, diferenciální sestřih): odhad retence exonu. Příklady jsou DEXSeq,[105] KOBERCE,[106] a SeqGSEA.[107]
  • Na základě izoformy (také vícečetné moduly, diferenciální výraz izoformy): nejprve odhadněte početnost izoformy a poté relativní hojnost mezi podmínkami. Příkladem jsou manžetové knoflíčky 2[108] a DiffSplice.[109]
  • Intronová excize na základě: vypočítat alternativní sestřih pomocí split čtení. Příkladem je MAJIQ[110] a řezačka listí.[104]

Nástroje diferenciální genové exprese lze také použít pro diferenciální expresi izoformy, pokud jsou izoformy kvantifikovány předem s jinými nástroji, jako je RSEM.[111]

Koexpresní sítě

Koexpresní sítě jsou reprezentace dat odvozených od genů chujících se podobným způsobem napříč tkáněmi a experimentálními podmínkami.[112] Jejich hlavní účel spočívá v generování hypotéz a přístupech viny za asociací pro odvození funkcí dříve neznámých genů.[112] Data RNA-Seq byla použita k odvození genů zapojených do specifických drah na základě Pearsonova korelace, a to jak v rostlinách[113] a savci.[114] Hlavní výhodou dat RNA-Seq v tomto druhu analýzy přes platformy microarray je schopnost pokrýt celý transkriptom, což umožňuje možnost odhalit úplnější reprezentace genových regulačních sítí. Diferenciální regulace spojovacích izoforem stejného genu může být detekována a použita k předpovědi a jejich biologickým funkcím.[115][116] Vážená genová koexpresní síťová analýza byl úspěšně použit k identifikaci koexpresních modulů a genů intramodulárního rozbočovače na základě dat RNA seq. Moduly společné exprese mohou odpovídat buněčným typům nebo drahám. Vysoce propojené intramodulární rozbočovače lze interpretovat jako zástupce příslušného modulu. Eigengen je vážený součet exprese všech genů v modulu. Eigengeny jsou užitečné biomarkery (vlastnosti) pro diagnostiku a prognózu.[117] Byly navrženy přístupy transformace stabilizující rozptyl pro odhad korelačních koeficientů na základě dat RNA seq.[113]

Objev variant

RNA-Seq zachycuje variace DNA, včetně jednotlivé nukleotidové varianty, malá vložení / vymazání. a strukturální variace. Varianta volání v RNA-Seq je podobný volání varianty DNA a často používá stejné nástroje (včetně SAMtools mpileup[118] a GATK HaplotypeCaller[119]) s úpravami, které zohledňují spojování. Jedna jedinečná dimenze pro varianty RNA je alelově specifický výraz (ASE): varianty pouze z jednoho haplotypu mohou být přednostně vyjádřeny v důsledku regulačních účinků včetně potisk a exprese kvantitativní znak loci a nekódující vzácné varianty.[120][121] Omezení identifikace varianty RNA zahrnují, že odráží pouze exprimované oblasti (u lidí <5% genomu) a má nižší kvalitu ve srovnání s přímým sekvenováním DNA.

Editace RNA (post-transkripční změny)

Viz také: Úpravy RNA

Mít odpovídající genomové a transkriptomické sekvence jednotlivce může pomoci detekovat post-transkripční úpravy (Úpravy RNA ).[3] Událost post-transkripční modifikace je identifikována, pokud má transkript genu alelu / variantu, která nebyla v genomových datech pozorována.

Mapování RNA-Seq krátkých čtení přes křižovatky exon-exon, v závislosti na tom, kam se každý konec mapuje, lze definovat a Trans nebo a Cis událost.

Detekce fúzního genu

Viz také: Fúzní gen

Fúzní geny, způsobené různými strukturálními modifikacemi v genomu, získaly pozornost kvůli jejich vztahu k rakovině.[122] Schopnost RNA-Seq analyzovat celý transkriptom vzorku nezaujatým způsobem z něj činí atraktivní nástroj k nalezení těchto druhů běžných událostí u rakoviny.[4]

Myšlenka vyplývá z procesu srovnávání krátkých transkriptomických čtení s referenčním genomem. Většina krátkých čtení spadá do jednoho úplného exonu a očekává se, že menší, ale stále velká sada bude mapována na známé křižovatky exon-exon. Zbývající nezmapovaná krátká čtení by pak byla dále analyzována, aby se zjistilo, zda odpovídají spojení exon-exon, kde exony pocházejí z různých genů. To by byl důkaz možné události fúze, ale vzhledem k délce čtení by se to mohlo ukázat jako velmi hlučné. Alternativním přístupem je použití čtení na párových koncích, kdy by potenciálně velký počet spárovaných čtení mapoval každý konec na jiný exon, což by poskytlo lepší pokrytí těchto událostí (viz obrázek). Konečný výsledek nicméně sestává z mnoha a potenciálně nových kombinací genů poskytujících ideální výchozí bod pro další validaci.

Dějiny

Počet rukopisů na PubMed s RNA-Seq stále roste.

RNA-Seq byl poprvé vyvinut v polovině 2000s s příchodem technologie sekvenování nové generace.[123] První rukopisy, které používaly RNA-Seq i bez použití tohoto termínu, zahrnují rukopisy rakovina prostaty buněčné linie[124] (ze dne 2006), Medicago truncatula[125] (2006), kukuřice[126] (2007) a Arabidopsis thaliana[127] (2007), zatímco samotný termín „RNA-Seq“ byl poprvé zmíněn v roce 2008.[128] Počet rukopisů odkazujících na RNA-Seq v názvu nebo abstraktu (obrázek, modrá čára) se neustále zvyšuje s 6754 rukopisy publikovanými v roce 2018 (odkaz na vyhledávání PubMed ). Průsečík RNA-Seq a medicíny (obrázek, zlatá čára, odkaz na vyhledávání PubMed ) má podobnou celeritu.[původní výzkum? ]

Aplikace v medicíně

RNA-Seq má potenciál identifikovat novou biologii nemocí, profilovat biomarkery pro klinické indikace, odvodit léčebné cesty a provádět genetické diagnózy. Tyto výsledky by mohly být dále přizpůsobeny pro podskupiny nebo dokonce pro jednotlivé pacienty, což by mohlo zdůraznit účinnější prevenci, diagnostiku a terapii. Proveditelnost tohoto přístupu je částečně dána náklady v penězích a čase; souvisejícím omezením je požadovaný tým specialistů (bioinformatici, lékaři / kliničtí lékaři, základní výzkumní pracovníci, technici), aby plně interpretovali obrovské množství dat generovaných touto analýzou.[129]

Velké úsilí v oblasti sekvenování

Velký důraz byl kladen na data RNA-Seq po Encyklopedie prvků DNA (ENCODE) a Atlas rakovinového genomu (TCGA) projekty tento přístup využily k charakterizaci desítek buněčných linií[130] a tisíce vzorků primárních nádorů,[131] resp. ENCODE zaměřený na identifikaci regulačních oblastí v celém genomu v různých kohortách buněčných linií a transkriptomické údaje jsou zásadní, aby bylo možné pochopit následný účinek těchto epigenetických a genetických regulačních vrstev. TCGA se místo toho zaměřila na shromáždění a analýzu tisíců vzorků pacientů od 30 různých typů nádorů, aby pochopila základní mechanismy maligní transformace a progrese. V této souvislosti poskytují data RNA-Seq jedinečný snímek transkriptomického stavu onemocnění a zkoumají nestrannou populaci transkriptů, která umožňuje identifikaci nových transkriptů, fúzních transkriptů a nekódujících RNA, které by nebylo možné detekovat různými technologiemi.

Viz také

Reference

  1. ^ Shafee T, Lowe R (2017). "Eukaryotická a prokaryotická genová struktura". WikiJournal of Medicine. 4 (1). doi:10.15347 / wjm / 2017.002.
  2. ^ Chu Y, Corey DR (srpen 2012). „Sekvenování RNA: výběr platformy, experimentální design a interpretace dat“. Nukleová kyselina Therapeutics. 22 (4): 271–4. doi:10.1089 / nat.2012.0367. PMC  3426205. PMID  22830413.
  3. ^ A b C Wang Z, Gerstein M, Snyder M (leden 2009). „RNA-Seq: revoluční nástroj pro transkriptomiku“. Recenze přírody. Genetika. 10 (1): 57–63. doi:10.1038 / nrg2484. PMC  2949280. PMID  19015660.
  4. ^ A b Maher CA, Kumar-Sinha C, Cao X, Kalyana-Sundaram S, Han B, Jing X a kol. (Březen 2009). "Transkriptomové sekvenování k detekci genových fúzí u rakoviny". Příroda. 458 (7234): 97–101. Bibcode:2009Natur.458 ... 97M. doi:10.1038 / nature07638. PMC  2725402. PMID  19136943.
  5. ^ Ingolia NT, Brar GA, Rouskin S, McGeachy AM, Weissman JS (červenec 2012). „Strategie profilování ribozomu pro monitorování translace in vivo hlubokým sekvenováním fragmentů mRNA chráněných ribozomy“. Přírodní protokoly. 7 (8): 1534–50. doi:10.1038 / nprot.2012.086. PMC  3535016. PMID  22836135.
  6. ^ Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, Kalhor R, Yang JL, Ferrante TC a kol. (Březen 2014). "Vysoce multiplexované subcelulární RNA sekvenování in situ". Věda. 343 (6177): 1360–3. Bibcode:2014Sci ... 343.1360L. doi:10.1126 / science.1250212. PMC  4140943. PMID  24578530.
  7. ^ Kukurba KR, Montgomery SB (duben 2015). "Sekvenování a analýza RNA". Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11): 951–69. doi:10.1101 / pdb.top084970. PMC  4863231. PMID  25870306.
  8. ^ A b C d E Griffith M, Walker JR, Spies NC, Ainscough BJ, Griffith OL (srpen 2015). „Informatics for RNA Sequencing: a Web Resource for Analysis on the cloud“. PLOS výpočetní biologie. 11 (8): e1004393. Bibcode:2015PLSCB..11E4393G. doi:10.1371 / journal.pcbi.1004393. PMC  4527835. PMID  26248053.
  9. ^ "RNA-seqlopedia". rnaseq.uoregon.edu. Citováno 2017-02-08.
  10. ^ Morin R, Bainbridge M, Fejes A, Hirst M, Krzywinski M, Pugh T a kol. (Červenec 2008). „Profilování transkriptomu HeLa S3 pomocí náhodně aktivované cDNA a masivně paralelního sekvenování krátkého čtení“. Biotechniky. 45 (1): 81–94. doi:10.2144/000112900. PMID  18611170.
  11. ^ A b C Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B (červenec 2008). "Mapování a kvantifikace savčích transkriptomů pomocí RNA-Seq". Přírodní metody. 5 (7): 621–8. doi:10.1038 / nmeth.1226. PMID  18516045. S2CID  205418589.
  12. ^ Chen EA, Souaiaia T, Herstein JS, Evgrafov OV, Spitsyna VN, Rebolini DF, Knowles JA (říjen 2014). "Vliv integrity RNA na jedinečně mapovaná čtení v RNA-Seq". Poznámky k výzkumu BMC. 7 (1): 753. doi:10.1186/1756-0500-7-753. PMC  4213542. PMID  25339126.
  13. ^ Liu D, Graber JH (únor 2006). „Kvantitativní srovnání knihoven EST vyžaduje kompenzaci za systematické předsudky při generování cDNA“. BMC bioinformatika. 7: 77. doi:10.1186/1471-2105-7-77. PMC  1431573. PMID  16503995.
  14. ^ Garalde DR, Snell EA, Jachimowicz D, Sipos B, Lloyd JH, Bruce M a kol. (Březen 2018). "Vysoce paralelní přímé sekvenování RNA na poli nanopórů". Přírodní metody. 15 (3): 201–206. doi:10.1038 / nmeth.4577. PMID  29334379. S2CID  3589823.
  15. ^ A b "Shapiro E, Biezuner T, Linnarsson S (září 2013). „Technologie založené na sekvenování jednotlivých buněk způsobí revoluci ve vědě celého organismu.“ Recenze přírody. Genetika. 14 (9): 618–30. doi:10.1038 / nrg3542. PMID  23897237. S2CID  500845."
  16. ^ Kolodziejczyk AA, Kim JK, Svensson V, Marioni JC, Teichmann SA (květen 2015). „Technologie a biologie sekvenování jednobuněčné RNA“. Molekulární buňka. 58 (4): 610–20. doi:10.1016 / j.molcel.2015.04.005. PMID  26000846.
  17. ^ Montoro DT, Haber AL, Biton M, Vinarsky V, Lin B, Birket SE, et al. (Srpen 2018). "A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes". Příroda. 560 (7718): 319–324. Bibcode:2018Natur.560..319M. doi:10.1038/s41586-018-0393-7. PMC  6295155. PMID  30069044.
  18. ^ Plasschaert LW, Žilionis R, Choo-Wing R, Savova V, Knehr J, Roma G, et al. (Srpen 2018). "A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte". Příroda. 560 (7718): 377–381. Bibcode:2018Natur.560..377P. doi:10.1038/s41586-018-0394-6. PMC  6108322. PMID  30069046.
  19. ^ Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V a kol. (Květen 2015). „Čárové kódy kapiček pro transkriptomika jedné buňky aplikované na embryonální kmenové buňky“. Buňka. 161 (5): 1187–1201. doi:10.1016 / j.cell.2015.04.044. PMC  4441768. PMID  26000487.
  20. ^ Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. (Květen 2015). "Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets". Buňka. 161 (5): 1202–1214. doi:10.1016/j.cell.2015.05.002. PMC  4481139. PMID  26000488.
  21. ^ "Hebenstreit D (November 2012). "Methods, Challenges and Potentials of Single Cell RNA-seq". Biologie. 1 (3): 658–67. doi:10.3390/biology1030658. PMC  4009822. PMID  24832513."
  22. ^ Eberwine J, Sul JY, Bartfai T, Kim J (January 2014). "The promise of single-cell sequencing". Přírodní metody. 11 (1): 25–7. doi:10.1038/nmeth.2769. PMID  24524134. S2CID  11575439.
  23. ^ Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N a kol. (Květen 2009). msgstr "Analýza celého transkriptomu mRNA-Seq jedné buňky". Přírodní metody. 6 (5): 377–82. doi:10.1038/NMETH.1315. PMID  19349980. S2CID  16570747.
  24. ^ Islam S, Kjällquist U, Moliner A, Zajac P, Fan JB, Lönnerberg P, Linnarsson S (July 2011). "Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq". Výzkum genomu. 21 (7): 1160–7. doi:10.1101/gr.110882.110. PMC  3129258. PMID  21543516.
  25. ^ Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR, et al. (Srpen 2012). "Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells". Přírodní biotechnologie. 30 (8): 777–82. doi:10.1038/nbt.2282. PMC  3467340. PMID  22820318.
  26. ^ Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I (září 2012). „CEL-Seq: jednobuněčná RNA-Seq multiplexovanou lineární amplifikací“. Zprávy buněk. 2 (3): 666–73. doi:10.1016 / j.celrep.2012.08.003. PMID  22939981.
  27. ^ Singh M, Al-Eryani G, Carswell S, Ferguson JM, Blackburn J, Barton K, Roden D, Luciani F, Phan T, Junankar S, Jackson K, Goodnow CC, Smith MA, Swarbrick A (2018). „Vysoce výkonné cílené dlouho čitelné sekvenování jedné buňky odhaluje klonální a transkripční krajinu lymfocytů“. bioRxiv. doi:10.1101/424945. PMID  31311926.
  28. ^ Sasagawa Y, Nikaido I, Hayashi T, Danno H, Uno KD, Imai T, Ueda HR (duben 2013). „Quartz-Seq: vysoce reprodukovatelná a citlivá metoda jednobuněčného sekvenování RNA, odhaluje genetickou genetickou heterogenitu“. Genome Biology. 14 (4): R31. doi:10.1186 / gb-2013-14-4-r31. PMC  4054835. PMID  23594475.
  29. ^ Kouno T, Moody J, Kwon AT, Shibayama Y, Kato S, Huang Y a kol. (Leden 2019). „C1 CAGE detekuje počáteční místa transkripce a aktivitu zesilovače při rozlišení jedné buňky“. Příroda komunikace. 10 (1): 360. Bibcode:2019NatCo..10..360K. doi:10.1038 / s41467-018-08126-5. PMC  6341120. PMID  30664627.
  30. ^ Dal Molin A, Di Camillo B (2019). "How to design a single-cell RNA-sequencing experiment: pitfalls, challenges and perspectives". Briefings in Bioinformatics. 20 (4): 1384–1394. doi:10.1093/bib/bby007. PMID  29394315.
  31. ^ Peterson VM, Zhang KX, Kumar N, Wong J, Li L, Wilson DC, et al. (Říjen 2017). "Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells". Přírodní biotechnologie. 35 (10): 936–939. doi:10.1038/nbt.3973. PMID  28854175. S2CID  205285357.
  32. ^ Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, Houck-Loomis B, Chattopadhyay PK, Swerdlow H a kol. (Září 2017). „Simultánní měření epitopu a transkriptomu v jednotlivých buňkách“. Přírodní metody. 14 (9): 865–868. doi:10.1038 / nmeth.4380. PMC  5669064. PMID  28759029.
  33. ^ Raj B, Wagner DE, McKenna A, Pandey S, Klein AM, Shendure J a kol. (Červen 2018). „Simultánní jednobuněčný profil linií a typů buněk v mozku obratlovců“. Přírodní biotechnologie. 36 (5): 442–450. doi:10.1038 / nbt.4103. PMC  5938111. PMID  29608178.
  34. ^ Olmos D, Arkenau HT, Ang JE, Ledaki I, Attard G, Carden CP, et al. (Leden 2009). "Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience". Annals of Oncology. 20 (1): 27–33. doi:10.1093/annonc/mdn544. PMID  18695026.
  35. ^ Levitin HM, Yuan J, Sims PA (April 2018). "Single-Cell Transcriptomic Analysis of Tumor Heterogeneity". Trendy v rakovině. 4 (4): 264–268. doi:10.1016/j.trecan.2018.02.003. PMC  5993208. PMID  29606308.
  36. ^ Jerby-Arnon L, Shah P, Cuoco MS, Rodman C, Su MJ, Melms JC, et al. (Listopad 2018). "A Cancer Cell Program Promotes T Cell Exclusion and Resistance to Checkpoint Blockade". Buňka. 175 (4): 984–997.e24. doi:10.1016/j.cell.2018.09.006. PMC  6410377. PMID  30388455.
  37. ^ Stephenson W, Donlin LT, Butler A, Rozo C, Bracken B, Rashidfarrokhi A, et al. (Únor 2018). "Single-cell RNA-seq of rheumatoid arthritis synovial tissue using low-cost microfluidic instrumentation". Příroda komunikace. 9 (1): 791. Bibcode:2018NatCo...9..791S. doi:10.1038/s41467-017-02659-x. PMC  5824814. PMID  29476078.
  38. ^ Avraham R, Haseley N, Brown D, Penaranda C, Jijon HB, Trombetta JJ, et al. (Září 2015). "Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host Immune Responses". Buňka. 162 (6): 1309–21. doi:10.1016/j.cell.2015.08.027. PMC  4578813. PMID  26343579.
  39. ^ Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R a kol. (August 2017). „Komplexní transkripční profilování mnohobuněčného organismu v jedné buňce“. Věda. 357 (6352): 661–667. Bibcode:2017Sci ... 357..661C. doi:10.1126 / science.aam8940. PMC  5894354. PMID  28818938.
  40. ^ Plass M, Solana J, Wolf FA, Ayoub S, Misios A, Glažar P, et al. (Květen 2018). "Cell type atlas and lineage tree of a whole complex animal by single-cell transcriptomics". Věda. 360 (6391): eaaq1723. doi:10.1126/science.aaq1723. PMID  29674432.
  41. ^ Fincher CT, Wurtzel O, de Hoog T, Kravarik KM, Reddien PW (May 2018). "Schmidtea mediterranea". Věda. 360 (6391): eaaq1736. doi:10.1126/science.aaq1736. PMC  6563842. PMID  29674431.
  42. ^ Wagner DE, Weinreb C, Collins ZM, Briggs JA, Megason SG, Klein AM (červen 2018). „Jednobuněčné mapování krajiny a linie genové exprese v embryu zebrafish“. Věda. 360 (6392): 981–987. Bibcode:2018Sci ... 360..981W. doi:10.1126 / science.aar4362. PMC  6083445. PMID  29700229.
  43. ^ Farrell JA, Wang Y, Riesenfeld SJ, Shekhar K, Regev A, Schier AF (June 2018). "Single-cell reconstruction of developmental trajectories during zebrafish embryogenesis". Věda. 360 (6392): eaar3131. doi:10.1126/science.aar3131. PMC  6247916. PMID  29700225.
  44. ^ Briggs JA, Weinreb C, Wagner DE, Megason S, Peshkin L, Kirschner MW, Klein AM (June 2018). "The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution". Věda. 360 (6392): eaar5780. doi:10.1126/science.aar5780. PMC  6038144. PMID  29700227.
  45. ^ You J. "Science's 2018 Breakthrough of the Year: tracking development cell by cell". Vědecký časopis. Americká asociace pro rozvoj vědy.
  46. ^ A b Li H, Lovci MT, Kwon YS, Rosenfeld MG, Fu XD, Yeo GW (December 2008). "Determination of tag density required for digital transcriptome analysis: application to an androgen-sensitive prostate cancer model". Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 105 (51): 20179–84. Bibcode:2008PNAS..10520179L. doi:10.1073/pnas.0807121105. PMC  2603435. PMID  19088194.
  47. ^ A b Stegle O, Parts L, Piipari M, Winn J, Durbin R (February 2012). "Using probabilistic estimation of expression residuals (PEER) to obtain increased power and interpretability of gene expression analyses". Přírodní protokoly. 7 (3): 500–7. doi:10.1038/nprot.2011.457. PMC  3398141. PMID  22343431.
  48. ^ Kingsford C, Patro R (June 2015). "Reference-based compression of short-read sequences using path encoding". Bioinformatika. 31 (12): 1920–8. doi:10.1093/bioinformatics/btv071. PMC  4481695. PMID  25649622.
  49. ^ A b Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, Levin JZ, Thompson DA, Amit I, et al. (Květen 2011). „Kompletní transkriptomová sestava z dat RNA-Seq bez referenčního genomu“. Přírodní biotechnologie. 29 (7): 644–52. doi:10.1038 / nbt.1883. PMC  3571712. PMID  21572440.
  50. ^ "De Novo Assembly Using Illumina Reads" (PDF). Citováno 22. října 2016.
  51. ^ Zerbino DR, Birney E (May 2008). "Velvet: algoritmy pro de novo sestavení krátkého čtení pomocí grafů de Bruijn". Výzkum genomu. 18 (5): 821–9. doi:10.1101 / gr.074492.107. PMC  2336801. PMID  18349386.
  52. ^ Oases: a transcriptome assembler for very short reads
  53. ^ Chang Z, Li G, Liu J, Zhang Y, Ashby C, Liu D, et al. (Únor 2015). "Bridger: a new framework for de novo transcriptome assembly using RNA-seq data". Genome Biology. 16 (1): 30. doi:10.1186/s13059-015-0596-2. PMC  4342890. PMID  25723335.
  54. ^ A b Li B, Fillmore N, Bai Y, Collins M, Thomson JA, Stewart R, Dewey CN (December 2014). "Evaluation of de novo transcriptome assemblies from RNA-Seq data". Genome Biology. 15 (12): 553. doi:10.1186/s13059-014-0553-5. PMC  4298084. PMID  25608678.
  55. ^ A b Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. (Leden 2013). "STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner". Bioinformatika. 29 (1): 15–21. doi:10.1093/bioinformatics/bts635. PMC  3530905. PMID  23104886.
  56. ^ Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL (2009). "Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome". Genome Biology. 10 (3): R25. doi:10.1186/gb-2009-10-3-r25. PMC  2690996. PMID  19261174.
  57. ^ Trapnell C, Pachter L, Salzberg SL (May 2009). "TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq". Bioinformatika. 25 (9): 1105–11. doi:10.1093/bioinformatics/btp120. PMC  2672628. PMID  19289445.
  58. ^ Trapnell C, Roberts A, Goff L, Pertea G, Kim D, Kelley DR, et al. (Březen 2012). "Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks". Přírodní protokoly. 7 (3): 562–78. doi:10.1038/nprot.2012.016. PMC  3334321. PMID  22383036.
  59. ^ Liao Y, Smyth GK, Shi W (May 2013). "The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote". Výzkum nukleových kyselin. 41 (10): e108. doi:10.1093/nar/gkt214. PMC  3664803. PMID  23558742.
  60. ^ Kim D, Langmead B, Salzberg SL (April 2015). "HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements". Přírodní metody. 12 (4): 357–60. doi:10.1038/nmeth.3317. PMC  4655817. PMID  25751142.
  61. ^ Patro R, Mount SM, Kingsford C (May 2014). „Sailfish umožňuje kvantifikaci izoformy bez zarovnání ze čtení RNA-sek pomocí lehkých algoritmů“. Přírodní biotechnologie. 32 (5): 462–4. arXiv:1308.3700. doi:10.1038 / nbt.2862. PMC  4077321. PMID  24752080.
  62. ^ Bray NL, Pimentel H, Melsted P, Pachter L (May 2016). "Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification". Přírodní biotechnologie. 34 (5): 525–7. doi:10.1038/nbt.3519. PMID  27043002. S2CID  205282743.
  63. ^ Wu TD, Watanabe CK (May 2005). "GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences". Bioinformatika. 21 (9): 1859–75. doi:10.1093/bioinformatics/bti310. PMID  15728110.
  64. ^ Baruzzo G, Hayer KE, Kim EJ, Di Camillo B, FitzGerald GA, Grant GR (February 2017). "Simulation-based comprehensive benchmarking of RNA-seq aligners". Přírodní metody. 14 (2): 135–139. doi:10.1038/nmeth.4106. PMC  5792058. PMID  27941783.
  65. ^ Engström PG, Steijger T, Sipos B, Grant GR, Kahles A, Rätsch G, et al. (December 2013). "Systematic evaluation of spliced alignment programs for RNA-seq data". Přírodní metody. 10 (12): 1185–91. doi:10.1038/nmeth.2722. PMC  4018468. PMID  24185836.
  66. ^ Lu B, Zeng Z, Shi T (February 2013). "Comparative study of de novo assembly and genome-guided assembly strategies for transcriptome reconstruction based on RNA-Seq". Science China Life Sciences. 56 (2): 143–55. doi:10.1007/s11427-013-4442-z. PMID  23393030.
  67. ^ Bradnam KR, Fass JN, Alexandrov A, Baranay P, Bechner M, Birol I, et al. (Červenec 2013). „Assemblathon 2: hodnocení de novo metod montáže genomu u tří druhů obratlovců“. GigaScience. 2 (1): 10. arXiv:1301.5406. Bibcode:2013arXiv1301.5406B. doi:10.1186 / 2047-217X-2-10. PMC  3844414. PMID  23870653.
  68. ^ Greenbaum D, Colangelo C, Williams K, Gerstein M (2003). "Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale". Genome Biology. 4 (9): 117. doi:10.1186/gb-2003-4-9-117. PMC  193646. PMID  12952525.
  69. ^ Zhang ZH, Jhaveri DJ, Marshall VM, Bauer DC, Edson J, Narayanan RK, et al. (Srpen 2014). "A comparative study of techniques for differential expression analysis on RNA-Seq data". PLOS ONE. 9 (8): e103207. Bibcode:2014PLoSO...9j3207Z. doi:10.1371/journal.pone.0103207. PMC  4132098. PMID  25119138.
  70. ^ Anders S, Pyl PT, Huber W (January 2015). "HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data". Bioinformatika. 31 (2): 166–9. doi:10.1093/bioinformatics/btu638. PMC  4287950. PMID  25260700.
  71. ^ Liao Y, Smyth GK, Shi W (April 2014). "featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features". Bioinformatika. 30 (7): 923–30. arXiv:1305.3347. doi:10.1093/bioinformatics/btt656. PMID  24227677. S2CID  15960459.
  72. ^ Schmid MW, Grossniklaus U (February 2015). "Rcount: simple and flexible RNA-Seq read counting". Bioinformatika. 31 (3): 436–7. doi:10.1093/bioinformatics/btu680. PMID  25322836.
  73. ^ Finotello F, Lavezzo E, Bianco L, Barzon L, Mazzon P, Fontana P, et al. (2014). "Reducing bias in RNA sequencing data: a novel approach to compute counts". BMC bioinformatika. 15 Suppl 1 (Suppl 1): S7. doi:10.1186/1471-2105-15-s1-s7. PMC  4016203. PMID  24564404.
  74. ^ Hashimoto TB, Edwards MD, Gifford DK (March 2014). "Universal count correction for high-throughput sequencing". PLOS výpočetní biologie. 10 (3): e1003494. Bibcode:2014PLSCB..10E3494H. doi:10.1371/journal.pcbi.1003494. PMC  3945112. PMID  24603409.
  75. ^ A b Robinson MD, Oshlack A (2010). "A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data". Genome Biology. 11 (3): R25. doi:10.1186/gb-2010-11-3-r25. PMC  2864565. PMID  20196867.
  76. ^ Trapnell C, Williams BA, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G, van Baren MJ, et al. (Květen 2010). "Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation". Přírodní biotechnologie. 28 (5): 511–5. doi:10.1038/nbt.1621. PMC  3146043. PMID  20436464.
  77. ^ Pachter L (19 April 2011). "Models for transcript quantification from RNA-Seq". arXiv:1104.3889 [q-bio.GN ].
  78. ^ "What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units". The farrago. 8. května 2014. Citováno 28. března 2018.
  79. ^ Wagner GP, Kin K, Lynch VJ (December 2012). "Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples". Theory in Biosciences = Theorie in den Biowissenschaften. 131 (4): 281–5. doi:10.1007/s12064-012-0162-3. PMID  22872506. S2CID  16752581.
  80. ^ Evans, Ciaran; Hardin, Johanna; Stoebel, Daniel M (28 September 2018). "Selecting between-sample RNA-Seq normalization methods from the perspective of their assumptions". Briefings in Bioinformatics. 19 (5): 776–792. doi:10.1093/bib/bbx008. PMC  6171491. PMID  28334202.
  81. ^ A b Law CW, Chen Y, Shi W, Smyth GK (February 2014). "voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts". Genome Biology. 15 (2): R29. doi:10.1186/gb-2014-15-2-r29. PMC  4053721. PMID  24485249.
  82. ^ A b Anders S, Huber W (2010). "Diferenciální analýza výrazu pro data o počtu sekvencí". Genome Biology. 11 (10): R106. doi:10.1186 / gb-2010-11-10-r106. PMC  3218662. PMID  20979621.
  83. ^ A b Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK (January 2010). „edgeR: balíček Bioconductor pro diferenciální analýzu exprese dat digitální genové exprese“. Bioinformatika. 26 (1): 139–40. doi:10.1093 / bioinformatika / btp616. PMC  2796818. PMID  19910308.
  84. ^ Marguerat S, Schmidt A, Codlin S, Chen W, Aebersold R, Bähler J (October 2012). "Quantitative analysis of fission yeast transcriptomes and proteomes in proliferating and quiescent cells". Buňka. 151 (3): 671–83. doi:10.1016/j.cell.2012.09.019. PMC  3482660. PMID  23101633.
  85. ^ Owens ND, Blitz IL, Lane MA, Patrushev I, Overton JD, Gilchrist MJ, et al. (Leden 2016). "Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development". Zprávy buněk. 14 (3): 632–647. doi:10.1016/j.celrep.2015.12.050. PMC  4731879. PMID  26774488.
  86. ^ Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK (April 2015). "limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies". Výzkum nukleových kyselin. 43 (7): e47. doi:10.1093/nar/gkv007. PMC  4402510. PMID  25605792.
  87. ^ "Bioconductor - Open source software for bioinformatics".
  88. ^ Huber W, Carey VJ, Gentleman R, Anders S, Carlson M, Carvalho BS, et al. (Únor 2015). „Organizace vysoce výkonné genomické analýzy pomocí Bioconductor“. Přírodní metody. 12 (2): 115–21. doi:10.1038 / nmeth.3252. PMC  4509590. PMID  25633503.
  89. ^ Leek JT, Storey JD (September 2007). "Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis". Genetika PLOS. 3 (9): 1724–35. doi:10.1371/journal.pgen.0030161. PMC  1994707. PMID  17907809.
  90. ^ Pimentel H, Bray NL, Puente S, Melsted P, Pachter L (July 2017). "Differential analysis of RNA-seq incorporating quantification uncertainty". Přírodní metody. 14 (7): 687–690. doi:10.1038/nmeth.4324. PMID  28581496. S2CID  15063247.
  91. ^ Trapnell C, Hendrickson DG, Sauvageau M, Goff L, Rinn JL, Pachter L (January 2013). "Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq" (PDF). Přírodní biotechnologie. 31 (1): 46–53. doi:10.1038/nbt.2450. PMC  3869392. PMID  23222703.
  92. ^ Frazee AC, Pertea G, Jaffe AE, Langmead B, Salzberg SL, Leek JT (March 2015). "Ballgown bridges the gap between transcriptome assembly and expression analysis". Přírodní biotechnologie. 33 (3): 243–6. doi:10.1038/nbt.3172. PMC  4792117. PMID  25748911.
  93. ^ A b Sahraeian SM, Mohiyuddin M, Sebra R, Tilgner H, Afshar PT, Au KF, et al. (Červenec 2017). "Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis". Příroda komunikace. 8 (1): 59. Bibcode:2017NatCo...8...59S. doi:10.1038/s41467-017-00050-4. PMC  5498581. PMID  28680106.
  94. ^ Ziemann M, Eren Y, El-Osta A (srpen 2016). „Chyby ve jménech genů jsou ve vědecké literatuře rozšířené“. Genome Biology. 17 (1): 177. doi:10.1186 / s13059-016-1044-7. PMC  4994289. PMID  27552985.
  95. ^ Soneson C, Delorenzi M (March 2013). "A comparison of methods for differential expression analysis of RNA-seq data". BMC bioinformatika. 14: 91. doi:10.1186/1471-2105-14-91. PMC  3608160. PMID  23497356.
  96. ^ Fonseca NA, Marioni J, Brazma A (30 September 2014). "RNA-Seq gene profiling--a systematic empirical comparison". PLOS ONE. 9 (9): e107026. Bibcode:2014PLoSO...9j7026F. doi:10.1371/journal.pone.0107026. PMC  4182317. PMID  25268973.
  97. ^ Seyednasrollah F, Laiho A, Elo LL (January 2015). "Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies". Briefings in Bioinformatics. 16 (1): 59–70. doi:10.1093/bib/bbt086. PMC  4293378. PMID  24300110.
  98. ^ Rapaport F, Khanin R, Liang Y, Pirun M, Krek A, Zumbo P, et al. (2013). "Comprehensive evaluation of differential gene expression analysis methods for RNA-seq data". Genome Biology. 14 (9): R95. doi:10.1186/gb-2013-14-9-r95. PMC  4054597. PMID  24020486.
  99. ^ Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, et al. (Leden 2016). „Průzkum osvědčených postupů pro analýzu dat RNA-seq“. Genome Biology. 17 (1): 13. doi:10.1186 / s13059-016-0881-8. PMC  4728800. PMID  26813401.
  100. ^ Costa-Silva J, Domingues D, Lopes FM (21 December 2017). "RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool". PLOS ONE. 12 (12): e0190152. Bibcode:2017PLoSO..1290152C. doi:10.1371/journal.pone.0190152. PMC  5739479. PMID  29267363.
  101. ^ A b Keren H, Lev-Maor G, Ast G (May 2010). "Alternative splicing and evolution: diversification, exon definition and function". Recenze přírody. Genetika. 11 (5): 345–55. doi:10.1038/nrg2776. PMID  20376054. S2CID  5184582.
  102. ^ Liu R, Loraine AE, Dickerson JA (December 2014). "Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems". BMC bioinformatika. 15 (1): 364. doi:10.1186/s12859-014-0364-4. PMC  4271460. PMID  25511303.
  103. ^ Pachter, Lior (19 April 2011). "Models for transcript quantification from RNA-Seq". arXiv:1104.3889 [q-bio.GN ].
  104. ^ A b Li YI, Knowles DA, Humphrey J, Barbeira AN, Dickinson SP, Im HK, Pritchard JK (January 2018). "Annotation-free quantification of RNA splicing using LeafCutter". Genetika přírody. 50 (1): 151–158. doi:10.1038/s41588-017-0004-9. PMC  5742080. PMID  29229983.
  105. ^ Anders S, Reyes A, Huber W (October 2012). "Detecting differential usage of exons from RNA-seq data". Výzkum genomu. 22 (10): 2008–17. doi:10.1101/gr.133744.111. PMC  3460195. PMID  22722343.
  106. ^ Shen S, Park JW, Huang J, Dittmar KA, Lu ZX, Zhou Q, et al. (April 2012). "MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data". Výzkum nukleových kyselin. 40 (8): e61. doi:10.1093/nar/gkr1291. PMC  3333886. PMID  22266656.
  107. ^ Wang X, Cairns MJ (June 2014). "SeqGSEA: a Bioconductor package for gene set enrichment analysis of RNA-Seq data integrating differential expression and splicing". Bioinformatika. 30 (12): 1777–9. doi:10.1093/bioinformatics/btu090. PMID  24535097.
  108. ^ Trapnell C, Hendrickson DG, Sauvageau M, Goff L, Rinn JL, Pachter L (January 2013). "Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq". Přírodní biotechnologie. 31 (1): 46–53. doi:10.1038/nbt.2450. PMC  3869392. PMID  23222703.
  109. ^ Hu Y, Huang Y, Du Y, Orellana CF, Singh D, Johnson AR, et al. (Leden 2013). "DiffSplice: the genome-wide detection of differential splicing events with RNA-seq". Výzkum nukleových kyselin. 41 (2): e39. doi:10.1093/nar/gks1026. PMC  3553996. PMID  23155066.
  110. ^ Vaquero-Garcia J, Barrera A, Gazzara MR, González-Vallinas J, Lahens NF, Hogenesch JB, et al. (Únor 2016). "A new view of transcriptome complexity and regulation through the lens of local splicing variations". eLife. 5: e11752. doi:10.7554/eLife.11752. PMC  4801060. PMID  26829591.
  111. ^ Merino GA, Conesa A, Fernández EA (March 2019). "A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies". Briefings in Bioinformatics. 20 (2): 471–481. doi:10.1093/bib/bbx122. PMID  29040385. S2CID  22706028.
  112. ^ A b Marcotte EM, Pellegrini M, Thompson MJ, Yeates TO, Eisenberg D (November 1999). "A combined algorithm for genome-wide prediction of protein function". Příroda. 402 (6757): 83–6. Bibcode:1999Natur.402...83M. doi:10.1038/47048. PMID  10573421. S2CID  144447.
  113. ^ A b Giorgi FM, Del Fabbro C, Licausi F (March 2013). "Comparative study of RNA-seq- and microarray-derived coexpression networks in Arabidopsis thaliana". Bioinformatika. 29 (6): 717–24. doi:10.1093/bioinformatics/btt053. PMID  23376351.
  114. ^ Iancu OD, Kawane S, Bottomly D, Searles R, Hitzemann R, McWeeney S (June 2012). "Utilizing RNA-Seq data for de novo coexpression network inference". Bioinformatika. 28 (12): 1592–7. doi:10.1093/bioinformatics/bts245. PMC  3493127. PMID  22556371.
  115. ^ Eksi R, Li HD, Menon R, Wen Y, Omenn GS, Kretzler M, Guan Y (Nov 2013). "Systematically differentiating functions for alternatively spliced isoforms through integrating RNA-seq data". PLOS výpočetní biologie. 9 (11): e1003314. Bibcode:2013PLSCB...9E3314E. doi:10.1371/journal.pcbi.1003314. PMC  3820534. PMID  24244129.
  116. ^ Li HD, Menon R, Omenn GS, Guan Y (August 2014). "The emerging era of genomic data integration for analyzing splice isoform function". Trendy v genetice. 30 (8): 340–7. doi:10.1016/j.tig.2014.05.005. PMC  4112133. PMID  24951248.
  117. ^ Foroushani A, Agrahari R, Docking R, Chang L, Duns G, Hudoba M, et al. (Březen 2017). "Large-scale gene network analysis reveals the significance of extracellular matrix pathway and homeobox genes in acute myeloid leukemia: an introduction to the Pigengene package and its applications". BMC Medical Genomics. 10 (1): 16. doi:10.1186/s12920-017-0253-6. PMC  5353782. PMID  28298217.
  118. ^ Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, et al. (August 2009). "The Sequence Alignment/Map format and SAMtools". Bioinformatika. 25 (16): 2078–9. doi:10.1093/bioinformatics/btp352. PMC  2723002. PMID  19505943.
  119. ^ DePristo MA, Banks E, Poplin R, Garimella KV, Maguire JR, Hartl C, et al. (Květen 2011). "A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data". Genetika přírody. 43 (5): 491–8. doi:10.1038/ng.806. PMC  3083463. PMID  21478889.
  120. ^ Battle A, Brown CD, Engelhardt BE, Montgomery SB (October 2017). "Genetic effects on gene expression across human tissues". Příroda. 550 (7675): 204–213. Bibcode:2017Natur.550..204A. doi:10.1038/nature24277. PMC  5776756. PMID  29022597.
  121. ^ Richter F, Hoffman GE, Manheimer KB, Patel N, Sharp AJ, McKean D, et al. (Březen 2019). "ORE Identifies Extreme Expression Effects Enriched for Rare Variants". Bioinformatika. 35 (20): 3906–3912. doi:10.1093/bioinformatics/btz202. PMC  6792115. PMID  30903145.
  122. ^ Teixeira MR (prosinec 2006). "Opakované fúzní onkogeny v karcinomech". Kritické recenze v onkogenezi. 12 (3–4): 257–71. doi:10.1615 / critrevoncog.v12.i3-4,40. PMID  17425505.
  123. ^ Weber AP (November 2015). "Discovering New Biology through Sequencing of RNA". Fyziologie rostlin. 169 (3): 1524–31. doi:10.1104/pp.15.01081. PMC  4634082. PMID  26353759.
  124. ^ Bainbridge MN, Warren RL, Hirst M, Romanuik T, Zeng T, Go A, et al. (Září 2006). "Analysis of the prostate cancer cell line LNCaP transcriptome using a sequencing-by-synthesis approach". BMC Genomics. 7: 246. doi:10.1186/1471-2164-7-246. PMC  1592491. PMID  17010196.
  125. ^ Cheung F, Haas BJ, Goldberg SM, May GD, Xiao Y, Town CD (October 2006). "Sequencing Medicago truncatula expressed sequenced tags using 454 Life Sciences technology". BMC Genomics. 7: 272. doi:10.1186/1471-2164-7-272. PMC  1635983. PMID  17062153.
  126. ^ Emrich SJ, Barbazuk WB, Li L, Schnable PS (January 2007). "Gene discovery and annotation using LCM-454 transcriptome sequencing". Výzkum genomu. 17 (1): 69–73. doi:10.1101/gr.5145806. PMC  1716268. PMID  17095711.
  127. ^ Weber AP, Weber KL, Carr K, Wilkerson C, Ohlrogge JB (May 2007). "Sampling the Arabidopsis transcriptome with massively parallel pyrosequencing". Fyziologie rostlin. 144 (1): 32–42. doi:10.1104/pp.107.096677. PMC  1913805. PMID  17351049.
  128. ^ Nagalakshmi U, Wang Z, Waern K, Shou C, Raha D, Gerstein M, Snyder M (June 2008). "The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing". Věda. 320 (5881): 1344–9. Bibcode:2008Sci...320.1344N. doi:10.1126/science.1158441. PMC  2951732. PMID  18451266.
  129. ^ Sandberg, Rickard (2013-12-30). "Entering the era of single-cell transcriptomics in biology and medicine". Přírodní metody. 11 (1): 22–24. doi:10.1038/nmeth.2764. ISSN  1548-7091.
  130. ^ "ENCODE Data Matrix". Citováno 2013-07-28.
  131. ^ "The Cancer Genome Atlas - Data Portal". Citováno 2013-07-28.

externí odkazy