Sekvenování jednotlivých buněk - Single cell sequencing - Wikipedia

Sekvenování jednotlivých buněk zkoumá informace o sekvenci z jednotlivých buněk s optimalizovanými sekvenování nové generace (NGS) technologie, poskytující vyšší rozlišení buněčných rozdílů a lepší pochopení funkce jednotlivé buňky v kontextu jejího mikroprostředí.[1] Například u rakoviny může sekvenování DNA jednotlivých buněk poskytnout informace o mutacích nesených malými populacemi buněk. Při vývoji může sekvenování RNA exprimovaných jednotlivými buňkami poskytnout vhled do existence a chování různých typů buněk.[2] V mikrobiálních systémech se populace stejného druhu může zdát geneticky klonální, ale jednobuněčné sekvenování RNA nebo epigenetické modifikace mohou odhalit variabilitu mezi buňkami, která může pomoci populacím rychle se adaptovat na přežití v měnícím se prostředí.[3]

Pozadí

Typická lidská buňka se skládá z přibližně 2 x 3,3 miliardy párů bází DNA a 600 milionů bází mRNA. Obvykle se při sekvenování DNA nebo RNA pomocí tradičních metod používá směs milionů buněk Sangerovo sekvenování nebo Sekvenování Illumina. Pomocí hlubokého sekvenování DNA a RNA z jedné buňky lze rozsáhle zkoumat buněčné funkce.[1] Stejně jako typické experimenty NGS protokoly sekvenování jedné buňky obecně obsahují následující kroky: izolace jedné buňky, extrakce a amplifikace nukleové kyseliny, sekvenování knihovna příprava, řazení a bioinformatické analýza dat. Je náročnější provádět sekvenování jedné buňky ve srovnání s hromadným sekvenováním z buněk. Minimální množství výchozích materiálů z jedné buňky způsobuje, že degradace, ztráta vzorku a kontaminace mají výrazný vliv na kvalitu sekvenčních dat. Navíc, vzhledem k úrovni pikogramu množství použitých nukleových kyselin,[4] během přípravy vzorku jednobuněčného sekvenování je často nutná silná amplifikace, což vede k nerovnoměrnému pokrytí, šumu a nepřesné kvantifikaci sekvenčních dat.

Díky nedávným technickým vylepšením je sekvenování jednotlivých buněk slibným nástrojem pro řešení řady zdánlivě nepřístupných problémů. Například heterogenní vzorky, vzácné typy buněk, vztahy buněčné linie, mozaicismus somatických tkání, analýzy mikrobů, které nelze kultivovat, a vývoj nemoci lze vysvětlit sekvenováním jednotlivých buněk.[5] Sekvenování jednotlivých buněk bylo vybráno jako metoda roku 2013 společností Nature Publishing Group.[6]

Sekvenování jednobuněčného genomu (DNA)

Sekvenování genomu jednobuněčné DNA zahrnuje izolaci jedné buňky, amplifikaci celého požadovaného genomu nebo oblasti, konstrukci knihoven sekvenování a následnou aplikaci sekvenování DNA nové generace (např. Illumina, Ion Torrent ). V savčích systémech bylo jednobuněčné sekvenování DNA široce používáno ke studiu normální fyziologie a nemocí. Rozlišení jednotlivých buněk může odhalit role genetického mozaicismu nebo intra-nádorové genetické heterogenity ve vývoji rakoviny nebo v reakci na léčbu.[7] V souvislosti s mikrobiomy je genom z jediného jednobuněčného organismu označován jako jediný amplifikovaný genom (SAG). Pokroky v sekvenování jednobuněčné DNA umožnily sběr genomových dat z nekultivovaných prokaryotických druhů přítomných ve složitých mikrobiomech.[8] Ačkoli se SAG vyznačují nízkou úplností a významným zkreslením, nedávné výpočtové pokroky dosáhly shromáždění téměř úplných genomů z kompozitních SAG.[9] Data získaná z mikroorganismů mohou v budoucnu zavést procesy kultivace.[10] Některé z nástrojů pro shromažďování genomu, které lze použít při sekvenování genomu jedné buňky, zahrnují: SPAdes, IDBA-UD, Cortex a HyDA.[11]

Metody

Tento obrázek ilustruje kroky zapojené do pracovního postupu sekvenování genomu jedné buňky. MDA znamená vícenásobné zesílení posunutí.

A seznam více než 100 různých metod omics s jednou buňkou byly zveřejněny[12].

Zesílení vícenásobného posunutí (MDA) je široce používaná technika umožňující zesílení femtogramy DNA z bakterie do mikrogramů pro použití sekvenování. Mezi činidla potřebná pro reakce MDA patří: náhodné primery a DNA polymeráza z bakteriofága phi29. Při 30 stupňové izotermické reakci je DNA amplifikována pomocí zahrnutých reagencií. Jako polymerázy Při výrobě nových řetězců probíhá reakce vytěsnění vlákna, syntetizující více kopií z každé templátové DNA. Současně budou vytlačeny prameny, které byly předtím prodlouženy. Výsledkem produktů MDA je délka přibližně 12 kb a rozmezí přibližně 100 kb, což umožňuje jeho použití při sekvenování DNA.[10] V roce 2017 bylo zavedeno hlavní zdokonalení této techniky zvané WGA-X využitím termostabilní mutanty polymerázy phi29, což vedlo k lepšímu zotavení genomu z jednotlivých buněk, zejména těch s vysokým obsahem G + C.[13] MDA byl také implementován v systému založeném na mikrofluidních kapkách, aby se dosáhlo vysoce paralelní amplifikace celého genomu jedné buňky. Zapouzdřením jednotlivých buněk v kapičkách pro zachycení a amplifikaci DNA nabízí tato metoda ve srovnání s konvenční MDA sníženou zkreslení a zvýšenou propustnost.[14]

Další běžná metoda je MALBAC.[15] Tato metoda začíná izotermální amplifikací, jak je to provedeno v MDA, ale primery jsou lemovány „běžnou“ sekvencí pro downstream PCR amplifikaci. Jak se generují předběžné amplikony, společná sekvence podporuje autoligaci a tvorbu „smyček“, aby se zabránilo další amplifikaci. Na rozdíl od MDA se netvoří vysoce rozvětvená síť DNA. Místo toho jsou v dalším teplotním cyklu smyčky denaturovány, což umožňuje amplifikaci fragmentů pomocí PCR. MALBAC byl také implementován v mikrofluidním zařízení, ale výkon zesílení nebyl významně zlepšen zapouzdřením v kapkách nanoliterů.[16]

Porovnáním MDA a MALBAC vede MDA k lepšímu pokrytí genomu, ale MALBAC poskytuje rovnoměrnější pokrytí celého genomu. MDA může být pro identifikaci účinnější SNP, zatímco MALBAC je preferován pro detekci variant počtu kopií. Zatímco provádění MDA s mikrofluidním zařízením výrazně snižuje zkreslení a kontaminaci, chemie použitá v MALBAC neprokazuje stejný potenciál pro zlepšenou účinnost. Volba metody závisí na cíli sekvenování, protože každá metoda má jiné výhody.[7]

Omezení

MDA jednotlivých buněčných genomů vede k velmi nerovnoměrnému pokrytí genomu, tj. Relativní nadměrné zastoupení a nedostatečné zastoupení různých oblastí templátu, což vede ke ztrátě některých sekvencí. Tento proces má dvě složky: a) stochastické nadměrné a nedostatečné zesílení náhodných oblastí; ab) systematické zkreslení vůči regionům s vysokým% GC. Stochastická složka může být řešena spojením jednobuněčných MDA reakcí ze stejného buněčného typu za použití fluorescenční hybridizace in situ (FISH) a / nebo potvrzení po sekvenování.[10] Předpětí MDA vůči oblastem s vysokým% GC lze řešit použitím termostabilních polymeráz, například v procesu zvaném WGA-X.[13]

Jednonukleotidové polymorfismy (SNP), které jsou velkou částí genetických variací v lidský genom, a variace počtu kopií (CNV), představují problémy v sekvenování jedné buňky, stejně jako omezené množství DNA extrahované z jedné buňky. Vzhledem k malému množství DNA představuje přesná analýza DNA problémy i po amplifikaci, protože pokrytí je nízké a je náchylné k chybám. U MDA je průměrné pokrytí genomu méně než 80% a SNP, které nejsou pokryty sekvenčním čtením, budou odhlášeny. Kromě toho MDA vykazuje vysoký poměr alela výpadek, nedetekování alel z heterozygotních vzorků. V současné době se používají různé SNP algoritmy, ale žádný není specifický pro sekvenování jedné buňky. MDA s CNV také představuje problém identifikace falešných CNV, které skrývají skutečné CNV. K vyřešení tohoto problému, když lze generovat vzory z falešných CNV, mohou algoritmy detekovat a vymýtit tento šum za vzniku skutečných variant.[17]

Aplikace

Mikrobiomy patří mezi hlavní cíle genomiky jednotlivých buněk kvůli obtížnosti kultivace většiny mikroorganismů ve většině prostředí. Jednobuněčná genomika je mocný způsob, jak získat sekvence mikrobiálního genomu bez kultivace. Tento přístup byl široce používán na mořských, půdních, podpovrchových, organizmových a jiných typech mikrobiomů za účelem řešení široké škály otázek týkajících se mikrobiální ekologie, evoluce, veřejného zdraví a biotechnologického potenciálu.[18][19][20][21][22][23][24][25][26]

Sekvenování rakoviny je také objevující se aplikací scDNAseq. Čerstvé nebo zmrazené nádory lze docela dobře analyzovat a kategorizovat s ohledem na SCNA, SNV a přeskupení pomocí přístupů DNAS celého genomu.[27] Cancer scDNAseq je zvláště užitečný pro zkoumání hloubky složitosti a mutací sloučenin přítomných v amplifikovaných terapeutických cílech, jako jsou geny receptorové tyrosinkinázy (EGFR, PDGFRA atd.), Kde konvenční přístupy hromadného nádoru na úrovni populace nejsou schopny vyřešit vzorce výskytu těchto mutací v jednotlivých buňkách nádoru. Takové překrytí může poskytnout nadbytečnost aktivace dráhy a rezistence nádorových buněk.

Sekvenování methylomu DNA z jedné buňky

Jedna metoda pro sekvenování methylace DNA z jedné buňky.[28]

Jednobuněčné DNA methylome sekvenování kvantifikuje Methylace DNA. Existuje několik známých typů methylace, které se vyskytují v přírodě, včetně 5-methylcytosin (5mC), 5-hydroymethylcytosin (5 hmC), 6-methyladenin (6 mA) a 4 mC 4-methylcytosin (4 mC). U eukaryot, zejména zvířat, je 5mC rozšířený podél genomu a hraje důležitou roli v regulaci genové exprese potlačováním transponovatelné prvky.[29] Sekvenování 5 mC v jednotlivých buňkách může odhalit, jak epigenetické změny napříč geneticky identickými buňkami z jedné tkáně nebo populace vedou k buňkám s různými fenotypy.

Metody

Bisulfitové sekvenování se stal zlatým standardem v detekci a sekvenování 5 mC v jednotlivých buňkách.[30] Ošetření DNA hydrogensiřičitanem převádí zbytky cytosinu na uracil, ale zbytky 5-methylcytosinu zůstávají nedotčeny. Proto si DNA, která byla ošetřena hydrogensiřičitanem, zachovává pouze methylované cytosiny. Pro získání výstupu methylomu je sekvence ošetřená hydrogensiřičitanem srovnána s nemodifikovaným genomem. Sekvenování bisulfitu celého genomu bylo dosaženo v jednotlivých buňkách v roce 2014.[31] Metoda překonává ztrátu DNA spojenou s typickým postupem, kdy se před fragmentaci hydrogensiřičitanem přidávají sekvenční adaptéry. Místo toho jsou adaptéry přidány poté, co je DNA ošetřena a fragmentována bisulfitem, což umožňuje amplifikaci všech fragmentů pomocí PCR.[32] Pomocí hlubokého sekvenování tato metoda zachycuje ~ 40% z celkového CpG v každé buňce. Jedním ze způsobů, jak dále zlepšit pokrytí metody, by bylo zlepšit účinnost zachycení CpG amplifikací DNA před působením hydrogensiřičitanu.

Jednobuněčná redukovaná reprezentace bisulfitového sekvenování (scRRBS) je další metodou.[33] Tato metoda využívá tendenci methylovaných cytosinů ke shlukování na ostrovech CpG (CGI) k obohacování oblastí genomu s vysokým obsahem CpG. To snižuje náklady na sekvenování ve srovnání s bisulfitovým sekvenováním celého genomu, ale omezuje pokrytí této metody. Když RRBS se aplikuje na hromadné vzorky, je detekována většina CpG míst v genových promotorech, ale místo v genových promotorech tvoří pouze 10% CpG míst v celém genomu.[34] V jednotlivých buňkách je detekováno 40% CpG míst z hromadného vzorku. Pro zvýšení pokrytí lze tuto metodu použít i na malou skupinu jednotlivých buněk. Ve vzorku 20 sloučených jednotlivých buněk bylo detekováno 63% CpG míst z hromadného vzorku. Sdružování jednotlivých buněk je jednou ze strategií ke zvýšení pokrytí methylomu, ale za cenu zakrytí heterogenity v populaci buněk.

Omezení

Zatímco bisulfitové sekvenování zůstává nejpoužívanějším přístupem pro detekci 5mC, chemické zpracování je drsné a fragmentuje a degraduje DNA. Tento efekt se zhoršuje při přechodu z hromadných vzorků do jednotlivých buněk. Mezi další metody detekce methylace DNA patří restrikční enzymy citlivé na methylaci. Restrikční enzymy také umožňují detekci jiných typů methylace, například 6 mA s DpnI.[35] Sekvenování na bázi nanoporů také nabízí cestu pro přímé methylační sekvenování bez fragmentace nebo modifikace původní DNA. Pro sekvenování methylomů bakterií, které dominují 6 mA a 4 mC (na rozdíl od 5 mC u eukaryot), bylo použito sekvenování nanoporů, ale tato technika ještě nebyla zmenšena na jednotlivé buňky.[36]

Aplikace

Sekvenování metylace DNA s jednou buňkou bylo široce používáno k prozkoumání epigenetických rozdílů v geneticky podobných buňkách. K ověření těchto metod během jejich vývoje byla data jednobuněčného methylomu smíšené populace úspěšně klasifikována hierarchickým shlukováním za účelem identifikace odlišných typů buněk.[33] Další aplikace studuje jednotlivé buňky během prvních několika buněčných dělení v raném vývoji, aby pochopila, jak se z jednoho embrya vynořují různé typy buněk.[37] Pro studium vzácných, ale vysoce aktivních typů buněk v rakovině, jako jsou cirkulující nádorové buňky (CTC), bylo také použito jednobuněčné bisulfitové sekvenování celého genomu.[38]

Porovnání metod sekvenování methylace jednotlivých buněk z hlediska pokrytí k roku 2015 Mus musculus

Jednobuněčný test na chromatin přístupný k transposáze se sekvenováním (scATAC-seq)

Hlavní článek: ATAC-seq

Jednobuněčné sekvencování chromatinu přístupné transpozici mapuje dostupnost chromatinu napříč genomem. Transpozáza vloží sekvenční adaptéry přímo do otevřených oblastí chromatinu, což umožňuje amplifikaci a sekvenování těchto oblastí.[39]

Sekvenování transkriptomů s jednou buňkou (scRNA-seq)

Standardní metody jako např mikročipy a hromadně RNA sekvence analýza analyzuje expresi RNA z velké populace buněk. Ve smíšených populacích buněk mohou tato měření zakrýt kritické rozdíly mezi jednotlivými buňkami v těchto populacích.[40][41]

Sekvenování jednobuněčné RNA (scRNA-seq) poskytuje profily výrazů jednotlivých buněk a je považován za Zlatý standard pro definování buněčných stavů a ​​fenotypů od roku 2020.[42] Ačkoli není možné získat úplné informace o každé RNA exprimované každou buňkou, vzhledem k malému množství dostupného materiálu lze vzorce genové exprese identifikovat pomocí genu shlukové analýzy.[43] To může odhalit existenci vzácných typů buněk v buněčné populaci, které nikdy předtím nebyly vidět. Například zvané vzácné specializované buňky v plicích plicní ionocyty které vyjadřují Regulátor transmembránové vodivosti cystické fibrózy byly identifikovány v roce 2018 dvěma skupinami provádějícími scRNA-Seq na epitelu dýchacích cest.[44][45]

Metody

Pracovní postup sekvenování jednobuněčné RNA

Současné protokoly scRNA-seq zahrnují izolaci jednotlivých buněk a jejich RNA a následování stejných kroků jako hromadné RNA-seq: reverzní transkripce (RT), amplifikace, generování knihovny a sekvenování. První metody rozdělily jednotlivé buňky do samostatných jamek; novější metody zapouzdřují jednotlivé buňky v kapičkách v mikrofluidním zařízení, kde probíhá reverzní transkripční reakce, převádějící RNA na cDNA. Každá kapička nese „čárový kód“ DNA, který jedinečně označuje cDNA odvozené z jedné buňky. Jakmile je reverzní transkripce dokončena, mohou být cDNA z mnoha buněk smíchány dohromady pro sekvenování; přepisy z konkrétní buňky jsou identifikovány jedinečným čárovým kódem.[46][47]

Výzvy pro scRNA-Seq zahrnují zachování počátečního relativního množství mRNA v buňce a identifikaci vzácných transkriptů.[48] Krok reverzní transkripce je zásadní, protože účinnost RT reakce určuje, kolik populace RNA buňky bude nakonec analyzováno sekvencerem. Procesivita reverzních transkriptáz a použité primovací strategie mohou ovlivnit produkci cDNA v plné délce a generování knihoven předpojatých ke 3 'nebo 5' konci genů.

V kroku amplifikace se k amplifikaci cDNA v současné době používá buď PCR, nebo transkripce in vitro (IVT). Jednou z výhod metod založených na PCR je schopnost generovat cDNA plné délky. Různá účinnost PCR na konkrétních sekvencích (například obsah GC a struktura snapbacku) však může být také exponenciálně amplifikována, což vytváří knihovny s nerovnoměrným pokrytím. Na druhou stranu, zatímco knihovny generované IVT se mohou vyhnout zkreslení sekvencí vyvolaných PCR, specifické sekvence mohou být přepsány neefektivně, což způsobí výpadek sekvence nebo generování neúplných sekvencí.[1][40]Bylo publikováno několik protokolů scRNA-seq: Tang et al.,[49] STRT,[50] SMART-seq,[51] CEL-seq,[52]RAGE-seq,[53]Quartz-seq.[54]a C1-CAGE.[55] Tyto protokoly se liší z hlediska strategií reverzní transkripce, syntézy a amplifikace cDNA a možnosti přizpůsobit čárové kódy specifické pro sekvenci (tj. UMI ) nebo schopnost zpracovávat shromážděné vzorky.[56]

V roce 2017 byly zavedeny dva přístupy k současnému měření jednobuněčné exprese mRNA a proteinu prostřednictvím protilátek značených oligonukleotidy známých jako REAP-seq,[57] a CITE-seq.[58]

Omezení

Většina metod RNA-Seq závisí na poly (A) ocas zachycení k obohacení mRNA a vyčerpání hojné a neinformativní rRNA. Často se tedy omezují na sekvenování polyadenylovaných molekul mRNA. Nedávné studie si však nyní začínají uvědomovat význam nepoly (A) RNA, jako je dlouho nekódující RNA a mikroRNA v regulaci genové exprese. Small-seq je jednobuněčná metoda, která zachycuje malé RNA (<300 nukleotidů), jako jsou mikroRNA, fragmenty tRNA a malé nukleolární RNA v buňkách savců.[59] Tato metoda využívá kombinaci „oligonukleotidových masek“ (které inhibují zachycení vysoce hojných molekul rRNA 5,8S) a výběr velikosti k vyloučení velkých druhů RNA, jako jsou jiné vysoce hojné molekuly rRNA. Chcete-li cílit na větší nepoly (A) RNA, jako je dlouhá nekódující mRNA, histonová mRNA, kruhová RNA a enhancerová RNA, není výběr velikosti použitelný pro vyčerpání vysoce hojných molekul ribozomální RNA (rRNA 18S a 28s).[60] Jednobuněčný RamDA-Seq je metoda, která toho dosáhne provedením reverzní transkripce s náhodným primováním (amplifikace s náhodným posunem) v přítomnosti „ne tak náhodných“ (NSR) primerů speciálně navržených tak, aby se zabránilo primování na molekule rRNA.[61] I když tato metoda úspěšně zachycuje celkové transkripty RNA celé délky pro sekvenování a detekuje řadu nepoly (A) RNA s vysokou citlivostí, má určitá omezení. Primery NSR byly pečlivě navrženy podle sekvencí rRNA ve specifickém organismu (myši) a návrh nových sad primerů pro jiné druhy by vyžadoval značné úsilí.

Bakterie a jiné prokaryoty nejsou v současnosti přístupné jednobuněčným RNA-seq kvůli nedostatku polyadenylované mRNA. Vývoj jednobuněčných metod RNA-seq, které nezávisí na zachycení ocasu poly (A), tedy bude také nástrojem umožňujícím mikrobiomové studie rozlišení jednotlivých buněk. Hromadné bakteriální studie obvykle používají obecnou depleci rRNA k překonání nedostatku polyadenylované mRNA na bakteriích, ale na úrovni jedné buňky je celková RNA nalezená v jedné buňce příliš malá.[60] Nedostatek polyadenylované mRNA a nedostatek celkové RNA nalezené v buňkách jednotlivých bakterií jsou dvě důležité bariéry omezující rozmístění scRNA-seq v bakteriích.

Aplikace

scRNA-Seq se stává široce používaným napříč biologickými disciplínami včetně Vývojová biologie,[62] Neurologie,[63] Onkologie,[64][65][66] Imunologie,[67][68] Kardiovaskulární výzkum[69] a Infekční nemoc.[70][71]

Použitím strojové učení metody, byla použita data z hromadné RNA-Seq ke zvýšení poměru signál / šum v scRNA-Seq. Vědci konkrétně použili profily genové exprese z rakovina datové sady za účelem sestavení koexpresní sítě, a poté je aplikovali na profily exprese genů jedné buňky a získali tak robustnější metodu pro detekci přítomnosti mutací v jednotlivých buňkách pomocí úrovní transkriptu.[72]

Některé metody scRNA-seq byly také použity pro jednobuněčné mikroorganismy. SMART-seq2 byl použit pro analýzu jednobuněčných eukaryotických mikrobů, ale protože se opírá o zachycení ocasu poly (A), nebyl použit v prokaryotických buňkách.[73] K sekvenci jednotlivých parazitů malárie nebo jednotlivých kvasinkových buněk byly použity mikrofluidní přístupy, jako jsou Drop-seq a zařízení Fluidigm IFC-C1.[74][75] Studie jednobuněčných kvasinek se snažila charakterizovat toleranci heterogenního stresu v izogenních kvasinkových buňkách před a po vystavení kvasinek stresu solí. Jednobuněčná analýza několika transkripčních faktorů pomocí scRNA-seq odhalila heterogenitu v populaci. Tyto výsledky naznačují, že regulace se u členů populace liší, aby se zvýšila šance na přežití u zlomku populace.

První analýza jednobuněčných transkriptomů v prokaryotických druzích byla provedena za použití terminátorového exonukleázového enzymu k selektivní degradaci rRNA a zesílení kružnice (RCA) mRNA.[76] V této metodě byly konce jednovláknové DNA ligovány dohromady za vzniku kruhu a výsledná smyčka byla poté použita jako templát pro lineární amplifikaci RNA. Knihovna konečných produktů byla poté analyzována pomocí microarray, s nízkou odchylkou a dobrým pokrytím. RCA však nebyl testován s RNA-seq, který typicky využívá sekvenování příští generace. Jednobuněčná RNA-sekvence pro bakterie by byla velmi užitečná pro studium mikrobiomů. Byly by řešeny problémy, se kterými se setkáváme v konvenčních metodách hromadné metatranscriptomiky, jako je selhání zachycení druhů přítomných v malém množství a selhání řešení heterogenity mezi populacemi buněk.

scRNA-Seq poskytl značný pohled na vývoj embryí a organismů, včetně červa Caenorhabditis elegans,[77] a regenerativní planar Schmidtea mediterranea[78][79] a axolotl Ambystoma mexicanum.[80][81] První obratlovci, kteří byli takto mapováni, byli Zebrafish[82][83][84] a Xenopus laevis.[85] V každém případě bylo studováno několik stadií embrya, což umožnilo mapovat celý proces vývoje na bázi buňka po buňce. Věda uznal tyto zálohy jako rok 2018 Průlom roku.[86]

Úvahy

Izolace jednotlivých buněk

Existuje několik způsobů, jak izolovat jednotlivé buňky před amplifikací a sekvenováním celého genomu. Třídění buněk aktivované fluorescencí (FACS) je široce používaný přístup. Jednotlivé buňky lze také sbírat mikromanipulací, například sériovým ředěním nebo použitím pipety nebo nanotrubičky pro sklizeň jedné buňky.[87][88] Výhody mikromanipulace jsou snadnost a nízké náklady, ale jsou pracné a náchylné k chybné identifikaci typů buněk pod mikroskopem. Mikrodisekce s laserovým snímáním (LCM) lze také použít pro sběr jednotlivých buněk. Ačkoli LCM zachovává znalosti o prostorovém umístění vzorkované buňky v tkáni, je těžké zachytit celou jednu buňku, aniž by také sbírala materiály ze sousedních buněk.[40][89][90] Zahrnují také vysoce výkonné metody pro izolaci jedné buňky mikrofluidika. FACS i mikrofluidika jsou přesné, automatické a schopné izolovat nezaujaté vzorky. Obě metody však nejprve vyžadují odpojení buněk od jejich mikroprostředí, což způsobí narušení transkripčních profilů v analýze exprese RNA.[91][92]

Počet buněk, které mají být analyzovány

scRNA-sekv

Obecně řečeno, pro typickou hromadnou buňku Sekvenování RNA (RNA-seq) experiment, je generováno deset milionů čtení a gen s vyšší než prahovou hodnotou 50 čtení na kb na milion čtení (RPKM) je považován za exprimovaný. U genu dlouhého 1 kB to odpovídá 500 čtením a minimu variační koeficient (CV) 4% za předpokladu Poissonovo rozdělení. U typické savčí buňky obsahující 200 000 mRNA je nutné shromáždit údaje o sekvenování alespoň z 50 jednotlivých buněk, aby se dosáhlo této minimální hodnoty CV. Kvůli účinnosti reverzní transkripce a dalšího šumu zavedeného v experimentech je však pro přesnou analýzu exprese a identifikaci buněčného typu zapotřebí více buněk.[40]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C Eberwine J, Sul JY, Bartfai T, Kim J (leden 2014). "Příslib sekvenování podle jedné buňky". Přírodní metody. 11 (1): 25–7. doi:10.1038 / nmeth.2769. PMID  24524134. S2CID  11575439.
  2. ^ Pennisi E (duben 2018). "Kronika embryí, buňka po buňce, gen po genu". Věda. 360 (6387): 367. Bibcode:2018Sci ... 360..367P. doi:10.1126 / science.360.6387.367. PMID  29700246.
  3. ^ Saliba AE, Westermann AJ, Gorski SA, Vogel J (srpen 2014). „Jednobuněčný RNA-seq: pokroky a budoucí výzvy“. Výzkum nukleových kyselin. 42 (14): 8845–60. doi:10.1093 / nar / gku555. PMC  4132710. PMID  25053837.
  4. ^ Shintaku H, Nishikii H, Marshall LA, Kotera H, Santiago JG (únor 2014). "Separace na čipu a analýza RNA a DNA z jednotlivých buněk". Analytická chemie. 86 (4): 1953–7. doi:10.1021 / ac4040218. PMID  24499009.
  5. ^ Nawy T (leden 2014). "Sekvenování jednotlivých buněk". Přírodní metody. 11 (1): 18. doi:10.1038 / nmeth.2771. PMID  24524131. S2CID  5252333.
  6. ^ „Metoda roku 2013“. Přírodní metody. 11 (1): 1. ledna 2014. doi:10.1038 / nmeth.2801. PMID  24524124.
  7. ^ A b Gawad C, Koh W, Quake SR (březen 2016). „Sekvenování genomu jedné buňky: současný stav vědy“. Recenze přírody. Genetika. 17 (3): 175–88. doi:10.1038 / nrg.2015.16. PMID  26806412. S2CID  4800650.
  8. ^ Alneberg J, Karlsson CM, Divne AM, Bergin C, Homa F, Lindh MV a kol. (Září 2018). „Genomy z nekultivovaných prokaryot: srovnání genomů shromážděných v metagenomu a jedno amplifikovaných genomů“. Mikrobiom. 6 (1): 173. doi:10.1186 / s40168-018-0550-0. PMC  6162917. PMID  30266101.
  9. ^ Kogawa M, Hosokawa M, Nishikawa Y, Mori K, Takeyama H (únor 2018). „Získání vysoce kvalitních genomů z nekulturních mikrobů čištěním a společným shromážděním jednobuněčných amplifikovaných genomů“. Vědecké zprávy. 8 (1): 2059. Bibcode:2018NatSR ... 8,2059K. doi:10.1038 / s41598-018-20384-3. PMC  5794965. PMID  29391438.
  10. ^ A b C "Lasken RS (říjen 2007). "Jednobuněčné genomové sekvenování pomocí zesílení vícenásobného posunutí". Současný názor v mikrobiologii. 10 (5): 510–6. doi:10.1016 / j.mib.2007.08.005. PMID  17923430."
  11. ^ Taghavi Z, Movahedi NS, Draghici S, Chitsaz H (říjen 2013). „Destilované jednobuněčné genomové sekvenování a de novo montáž pro řídké mikrobiální komunity“. Bioinformatika. 29 (19): 2395–401. arXiv:1305.0062. Bibcode:2013arXiv1305.0062T. doi:10.1093 / bioinformatika / btt420. PMC  3777112. PMID  23918251.
  12. ^ „Single-Cell-Omics.v2.3.13 @albertvilella“. Google dokumenty. Citováno 2020-01-01.
  13. ^ A b Stepanauskas R, Fergusson EA, Brown J, Poulton NJ, Tupper B, Labonté JM a kol. (Červenec 2017). „Vylepšená obnova genomu a integrované analýzy velikosti buněk jednotlivých nekultivovaných mikrobiálních buněk a virových částic“. Příroda komunikace. 8 (1): 84. Bibcode:2017NatCo ... 8 ... 84S. doi:10.1038 / s41467-017-00128-z. PMC  5519541. PMID  28729688.
  14. ^ Hosokawa M, Nishikawa Y, Kogawa M, Takeyama H (červenec 2017). „Masivně paralelní amplifikace celého genomu pro jednobuněčné sekvenování pomocí kapičkové mikrofluidiky“. Vědecké zprávy. 7 (1): 5199. Bibcode:2017NatSR ... 7.5199H. doi:10.1038 / s41598-017-05436-4. PMC  5507899. PMID  28701744.
  15. ^ Zong C, Lu S, Chapman AR, Xie XS (prosinec 2012). "Detekce celého nukleomu jednonukleotidů a variací počtu kopií jedné lidské buňky". Věda. 338 (6114): 1622–6. Bibcode:2012Sci ... 338.1622Z. doi:10.1126 / science.1229164. PMC  3600412. PMID  23258894.
  16. ^ Yu Z, Lu S, Huang Y (říjen 2014). "Mikrofluidní zařízení pro amplifikaci celého genomu pro sekvenování jedné buňky". Analytická chemie. 86 (19): 9386–90. doi:10.1021 / ac5032176. PMID  25233049.
  17. ^ "Ning L, Liu G, Li G, Hou Y, Tong Y, He J (2014). „Aktuální výzvy v bioinformatice genomiky jednotlivých buněk“. Hranice v onkologii. 4 (7): 7. doi:10.3389 / fonc.2014.00007. PMC  3902584. PMID  24478987."
  18. ^ Blainey PC, Quake SR (leden 2014). „Disekující genomová rozmanitost, jedna buňka po druhé“. Přírodní metody. 11 (1): 19–21. doi:10.1038 / nmeth.2783. hdl:1721.1/106574. PMC  3947563. PMID  24524132.
  19. ^ Zhang K, Martiny AC, Reppas NB, Barry KW, Malek J, Chisholm SW, Church GM (červen 2006). "Sekvenování genomů z jednotlivých buněk polymerázovým klonováním". Přírodní biotechnologie. 24 (6): 680–6. doi:10.1038 / nbt1214. PMID  16732271. S2CID  2994579.
  20. ^ Yoon HS, Price DC, Stepanauskas R, Rajah VD, Sieracki ME, Wilson WH a kol. (Květen 2011). „Jednobuněčná genomika odhaluje interakce organismu s neobdělávanými mořskými protisty“. Věda. 332 (6030): 714–7. Bibcode:2011Sci ... 332..714Y. doi:10.1126 / science.1203163. PMID  21551060. S2CID  34343205.
  21. ^ Swan BK, Martinez-Garcia M, Preston CM, Sczyrba A, Woyke T, Lamy D a kol. (Září 2011). „Potenciál pro chemolithoautotrofii mezi liniemi všudypřítomných bakterií v temném oceánu“. Věda. 333 (6047): 1296–300. Bibcode:2011Sci ... 333.1296S. doi:10.1126 / science.1203690. PMID  21885783. S2CID  206533092.
  22. ^ Woyke T, Xie G, Copeland A, González JM, Han C, Kiss H a kol. (2009-04-23). „Sestavování mořského metagenomu po jedné buňce“. PLOS ONE. 4 (4): e5299. Bibcode:2009PLoSO ... 4,5299 W.. doi:10,1371 / journal.pone.0005299. PMC  2668756. PMID  19390573.
  23. ^ Swan BK, Tupper B, Sczyrba A, Lauro FM, Martinez-Garcia M, González JM a kol. (Červenec 2013). „Prevalentní genomové usměrňování a zeměpisná šířka divergence planktonních bakterií v povrchovém oceánu“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 110 (28): 11463–8. Bibcode:2013PNAS..11011463S. doi:10.1073 / pnas.1304246110. PMC  3710821. PMID  23801761.
  24. ^ Rinke C, Schwientek P, Sczyrba A, Ivanova NN, Anderson IJ, Cheng JF a kol. (Červenec 2013). „Pohledy na fylogenetický a kódovací potenciál mikrobiální temné hmoty“ (PDF). Příroda. 499 (7459): 431–7. Bibcode:2013Natur.499..431R. doi:10.1038 / příroda12352. PMID  23851394. S2CID  4394530.
  25. ^ Kashtan N, Roggensack SE, Rodrigue S, Thompson JW, Biller SJ, Coe A, et al. (Duben 2014). „Jednobuněčná genomika odhaluje stovky koexistujících subpopulací u divokého Prochlorococcus“. Věda. 344 (6182): 416–20. Bibcode:2014Sci ... 344..416K. doi:10.1126 / science.1248575. hdl:1721.1/92763. PMID  24763590. S2CID  13659345.
  26. ^ Pachiadaki MG, Sintes E, Bergauer K, Brown JM, Record NR, Swan BK a kol. (Listopad 2017). „Hlavní role bakterií oxidujících dusitany při fixaci uhlíku v temném oceánu“. Věda. 358 (6366): 1046–1051. Bibcode:2017Sci ... 358.1046P. doi:10.1126 / science.aan8260. PMID  29170234.
  27. ^ Francis JM, Zhang CZ, Maire CL, Jung J, Manzo VE, Adalsteinsson VA a kol. (Srpen 2014). „Varianta heterogenity EGFR v glioblastomu vyřešena sekvenováním jednoho jádra“. Objev rakoviny. 4 (8): 956–71. doi:10.1158 / 2159-8290.CD-13-0879. PMC  4125473. PMID  24893890.
  28. ^ Farlik M, Sheffield NC, Nuzzo A, Datlinger P, Schönegger A, Klughammer J, Bock C (březen 2015). „Single-cell DNA methylome sequencing and bioinformatic inference of epigenomic cell-state dynamika“. Zprávy buněk. 10 (8): 1386–97. doi:10.1016 / j.celrep.2015.02.001. PMC  4542311. PMID  25732828.
  29. ^ Zemach A, McDaniel IE, Silva P, Zilberman D (květen 2010). „Evoluční analýza metylace eukaryotické DNA v celém genomu“. Věda. 328 (5980): 916–9. Bibcode:2010Sci ... 328..916Z. doi:10.1126 / science.1186366. PMID  20395474. S2CID  206525166.
  30. ^ Crary-Dooley FK, Tam ME, Dunaway KW, Hertz-Picciotto I, Schmidt RJ, LaSalle JM (březen 2017). „Srovnání stávajících globálních testů methylace DNA s sekvenováním bisulfitů v celém genomu s nízkým pokrytím pro epidemiologické studie“. Epigenetika. 12 (3): 206–214. doi:10.1080/15592294.2016.1276680. PMC  5406214. PMID  28055307.
  31. ^ Smallwood SA, Lee HJ, Angermueller C, Krueger F, Saadeh H, Peat J a kol. (Srpen 2014). „Jednobuněčné sekvenování bisulfitu v celém genomu pro hodnocení epigenetické heterogenity“. Přírodní metody. 11 (8): 817–820. doi:10.1038 / nmeth.3035. PMC  4117646. PMID  25042786.
  32. ^ Miura F, Enomoto Y, Dairiki R, Ito T (září 2012). „Sekvenování bisulfitu celého genomu bez zesilovače značením adaptéru po bisulfitu“. Výzkum nukleových kyselin. 40 (17): e136. doi:10.1093 / nar / gks454. PMC  3458524. PMID  22649061.
  33. ^ A b Guo H, Zhu P, Wu X, Li X, Wen L, Tang F (prosinec 2013). „Jednobuněčné methylomy krajiny myších embryonálních kmenových buněk a raných embryí analyzovány pomocí redukovaného zobrazení bisulfitového sekvenování“. Výzkum genomu. 23 (12): 2126–35. doi:10,1101 / gr. 161679.113. PMC  3847781. PMID  24179143.
  34. ^ Gu H, Smith ZD, Bock C, Boyle P, Gnirke A, Meissner A (duben 2011). "Příprava redukovaných reprezentací bisulfitových sekvenčních knihoven pro profilování metylace DNA v genomovém měřítku". Přírodní protokoly. 6 (4): 468–81. doi:10.1038 / nprot.2010.190. PMID  21412275. S2CID  24912438.
  35. ^ Fu Y, Luo GZ, Chen K, Deng X, Yu M, Han D a kol. (Květen 2015). „N6-methyldeoxyadenosin označuje aktivní startovní místa transkripce v Chlamydomonas“. Buňka. 161 (4): 879–892. doi:10.1016 / j.cell.2015.04.010. PMC  4427561. PMID  25936837.
  36. ^ Beaulaurier J, Schadt EE, Fang G (březen 2019). „Dešifrování bakteriálních epigenomů pomocí moderních technologií sekvenování“. Recenze přírody. Genetika. 20 (3): 157–172. doi:10.1038 / s41576-018-0081-3. PMC  6555402. PMID  30546107.
  37. ^ Guo H, Zhu P, Yan L, Li R, Hu B, Lian Y a kol. (Červenec 2014). „Krajina methylace DNA lidských raných embryí“. Příroda. 511 (7511): 606–10. Bibcode:2014Natur.511..606G. doi:10.1038 / příroda13444. PMID  25079557. S2CID  4450377.
  38. ^ Gkountela S, Castro-Giner F, Szczerba BM, Vetter M, Landin J, Scherrer R a kol. (Leden 2019). „Cirkulující shlukování nádorových buněk formuje metylaci DNA, aby umožnilo očkování metastáz“. Buňka. 176 (1–2): 98–112.e14. doi:10.1016 / j.cell.2018.11.046. PMC  6363966. PMID  30633912.
  39. ^ Stein RA (1. července 2019). „Single-Cell Sequencing Sifts through Multiple Omics“. Citováno 1. srpna 2019.
  40. ^ A b C d "Shapiro E, Biezuner T, Linnarsson S (září 2013). „Technologie založené na sekvenování jednotlivých buněk způsobí revoluci ve vědě celého organismu.“ Recenze přírody. Genetika. 14 (9): 618–30. doi:10.1038 / nrg3542. PMID  23897237. S2CID  500845."
  41. ^ Kolodziejczyk AA, Kim JK, Svensson V, Marioni JC, Teichmann SA (květen 2015). „Technologie a biologie sekvenování jednobuněčné RNA“. Molekulární buňka. 58 (4): 610–20. doi:10.1016 / j.molcel.2015.04.005. PMID  26000846.
  42. ^ Tammela, Tuomas; Sage, Julien (2020). „Zkoumání heterogenity nádorů u myších modelů“. Roční přehled biologie rakoviny. 4: 99–119. doi:10.1146 / annurev-cancerbio-030419-033413.
  43. ^ Harris, Chris (2020). Analýza jednotlivých buněk transkriptomu u rakoviny prostaty (MSc). University of Otago.
  44. ^ Montoro DT, Haber AL, Biton M, Vinarsky V, Lin B, Birket SE a kol. (Srpen 2018). „Revidovaná epiteliální hierarchie dýchacích cest zahrnuje ionocyty exprimující CFTR“. Příroda. 560 (7718): 319–324. Bibcode:2018Natur.560..319M. doi:10.1038 / s41586-018-0393-7. PMC  6295155. PMID  30069044.
  45. ^ Plasschaert LW, Žilionis R, Choo-Wing R, Savova V, Knehr J, Roma G a kol. (Srpen 2018). „Jednobuněčný atlas epitelu dýchacích cest odhaluje plicní ionocyt bohatý na CFTR“. Příroda. 560 (7718): 377–381. Bibcode:2018Natur.560..377P. doi:10.1038 / s41586-018-0394-6. PMC  6108322. PMID  30069046.
  46. ^ Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V a kol. (Květen 2015). „Čárové kódy kapiček pro transkriptomika jedné buňky aplikované na embryonální kmenové buňky“. Buňka. 161 (5): 1187–1201. doi:10.1016 / j.cell.2015.04.044. PMC  4441768. PMID  26000487.
  47. ^ Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M a kol. (Květen 2015). „Vysoce paralelní profilování exprese jednotlivých buněk v celém genomu pomocí kapiček Nanoliter“. Buňka. 161 (5): 1202–1214. doi:10.1016 / j.cell.2015.05.002. PMC  4481139. PMID  26000488.
  48. ^ "Hebenstreit D (listopad 2012). „Metody, výzvy a potenciály jednobuněčných RNA-seq“. Biologie. 1 (3): 658–67. doi:10,3390 / biologie1030658. PMC  4009822. PMID  24832513."
  49. ^ Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N a kol. (Květen 2009). msgstr "Analýza celého transkriptomu mRNA-Seq jedné buňky". Přírodní metody. 6 (5): 377–82. doi:10,1038 / NMETH.1315. PMID  19349980. S2CID  16570747.
  50. ^ Islam S, Kjällquist U, Moliner A, Zajac P, Fan JB, Lönnerberg P, Linnarsson S (červenec 2011). "Charakterizace transkripční krajiny jedné buňky vysoce multiplexním RNA-seq". Výzkum genomu. 21 (7): 1160–7. doi:10,1101 / gr. 110882.110. PMC  3129258. PMID  21543516.
  51. ^ Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR a kol. (Srpen 2012). „Plná délka mRNA-sekvence z jednobuněčných hladin RNA a jednotlivých cirkulujících nádorových buněk“. Přírodní biotechnologie. 30 (8): 777–82. doi:10,1038 / nbt.2282. PMC  3467340. PMID  22820318.
  52. ^ Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I (září 2012). „CEL-Seq: jednobuněčná RNA-Seq multiplexovanou lineární amplifikací“. Zprávy buněk. 2 (3): 666–73. doi:10.1016/j.celrep.2012.08.003. PMID  22939981.
  53. ^ Singh M, Al-Eryani G, Carswell S, Ferguson JM, Blackburn J, Barton K, et al. (Červenec 2019). "High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes". Příroda komunikace. 10 (1): 3120. Bibcode:2019NatCo..10.3120S. doi:10.1038/s41467-019-11049-4. PMC  6635368. PMID  31311926.
  54. ^ Sasagawa Y, Nikaido I, Hayashi T, Danno H, Uno KD, Imai T, Ueda HR (April 2013). "Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity". Genome Biology. 14 (4): R31. doi:10.1186/gb-2013-14-4-r31. PMC  4054835. PMID  23594475.
  55. ^ Kouno T, Moody J, Kwon AT, Shibayama Y, Kato S, Huang Y, et al. (Leden 2019). "C1 CAGE detects transcription start sites and enhancer activity at single-cell resolution". Příroda komunikace. 10 (1): 360. Bibcode:2019NatCo..10..360K. doi:10.1038/s41467-018-08126-5. PMC  6341120. PMID  30664627.
  56. ^ Dal Molin A, Di Camillo B (July 2019). "How to design a single-cell RNA-sequencing experiment: pitfalls, challenges and perspectives". Briefings in Bioinformatics. 20 (4): 1384–1394. doi:10.1093/bib/bby007. PMID  29394315.
  57. ^ Peterson VM, Zhang KX, Kumar N, Wong J, Li L, Wilson DC, et al. (Říjen 2017). "Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells". Přírodní biotechnologie. 35 (10): 936–939. doi:10.1038/nbt.3973. PMID  28854175. S2CID  205285357.
  58. ^ Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, Houck-Loomis B, Chattopadhyay PK, Swerdlow H, et al. (Září 2017). "Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells". Přírodní metody. 14 (9): 865–868. doi:10.1038/nmeth.4380. PMC  5669064. PMID  28759029.
  59. ^ Hagemann-Jensen M, Abdullayev I, Sandberg R, Faridani OR (October 2018). "Small-seq for single-cell small-RNA sequencing". Přírodní protokoly. 13 (10): 2407–2424. doi:10.1038/s41596-018-0049-y. PMID  30250291. S2CID  52813142.
  60. ^ A b Hayashi T, Ozaki H, Sasagawa Y, Umeda M, Danno H, Nikaido I (February 2018). "Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs". Příroda komunikace. 9 (1): 619. Bibcode:2018NatCo...9..619H. doi:10.1038/s41467-018-02866-0. PMC  5809388. PMID  29434199.
  61. ^ Armour CD, Castle JC, Chen R, Babak T, Loerch P, Jackson S, et al. (Září 2009). "Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis". Přírodní metody. 6 (9): 647–9. doi:10.1038/nmeth.1360. PMID  19668204. S2CID  12164981.
  62. ^ Griffiths, JA; Scialdone, A; Marioni, JC (16 April 2018). "Using single-cell genomics to understand developmental processes and cell fate decisions". Molekulární biologie systémů. 14 (4): e8046. doi:10.15252/msb.20178046. PMC  5900446. PMID  29661792.
  63. ^ Raj B, Wagner DE, McKenna A, Pandey S, Klein AM, Shendure J, et al. (Červen 2018). "Simultaneous single-cell profiling of lineages and cell types in the vertebrate brain". Přírodní biotechnologie. 36 (5): 442–450. doi:10.1038/nbt.4103. PMC  5938111. PMID  29608178.
  64. ^ Olmos D, Arkenau HT, Ang JE, Ledaki I, Attard G, Carden CP, et al. (Leden 2009). "Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience". Annals of Oncology. 20 (1): 27–33. doi:10.1093/annonc/mdn544. PMID  18695026.
  65. ^ Levitin HM, Yuan J, Sims PA (April 2018). "Single-Cell Transcriptomic Analysis of Tumor Heterogeneity". Trends in Cancer. 4 (4): 264–268. doi:10.1016/j.trecan.2018.02.003. PMC  5993208. PMID  29606308.
  66. ^ Jerby-Arnon L, Shah P, Cuoco MS, Rodman C, Su MJ, Melms JC, et al. (Listopad 2018). "A Cancer Cell Program Promotes T Cell Exclusion and Resistance to Checkpoint Blockade". Buňka. 175 (4): 984–997.e24. doi:10.1016/j.cell.2018.09.006. PMC  6410377. PMID  30388455.
  67. ^ Neu, KE; Tang, Q; Wilson, PC; Khan, AA (February 2017). "Single-Cell Genomics: Approaches and Utility in Immunology". Trendy v imunologii. 38 (2): 140–149. doi:10.1016/j.it.2016.12.001. PMC  5479322. PMID  28094102.
  68. ^ Stephenson W, Donlin LT, Butler A, Rozo C, Bracken B, Rashidfarrokhi A, et al. (Únor 2018). "Single-cell RNA-seq of rheumatoid arthritis synovial tissue using low-cost microfluidic instrumentation". Příroda komunikace. 9 (1): 791. Bibcode:2018NatCo...9..791S. doi:10.1038/s41467-017-02659-x. PMC  5824814. PMID  29476078.
  69. ^ Kuppe, Christoph; Ibrahim, Mahmoud M .; Kranz, Jennifer; Zhang, Xiaoting; Ziegler, Susanne; Perales-Patón, Javier; Jansen, Jitske; Reimer, Katharina C .; Smith, James R .; Dobie, Ross; Wilson-Kanamari, John R. (11. 11. 2020). „Dekódování původu myofibroblastů při fibróze lidských ledvin“. Příroda: 1–9. doi:10.1038 / s41586-020-2941-1. ISSN  1476-4687. PMID  33176333.
  70. ^ Avraham R, Haseley N, Brown D, Penaranda C, Jijon HB, Trombetta JJ, et al. (Září 2015). "Pathogen Cell-to-Cell Variability Drives Heterogeneity in Host Immune Responses". Buňka. 162 (6): 1309–21. doi:10.1016/j.cell.2015.08.027. PMC  4578813. PMID  26343579.
  71. ^ Bossel Ben-Moshe N, Hen-Avivi S, Levitin N, Yehezkel D, Oosting M, Joosten LA, et al. (Červenec 2019). "Predicting bacterial infection outcomes using single cell RNA-sequencing analysis of human immune cells". Příroda komunikace. 10 (1): 3266. Bibcode:2019NatCo..10.3266B. doi:10.1038/s41467-019-11257-y. PMC  6646406. PMID  31332193.
  72. ^ Mercatelli, Daniele; Ray, Forest; Giorgi, Federico M. (2019). "Pan-Cancer and Single-Cell Modeling of Genomic Alterations Through Gene Expression". Frontiers in Genetics. 10: 671. doi:10.3389/fgene.2019.00671. ISSN  1664-8021. PMC  6657420. PMID  31379928.
  73. ^ Reid AJ, Talman AM, Bennett HM, Gomes AR, Sanders MJ, Illingworth CJ, et al. (Březen 2018). "Single-cell RNA-seq reveals hidden transcriptional variation in malaria parasites". eLife. 7: e33105. doi:10.7554/eLife.33105. PMC  5871331. PMID  29580379.
  74. ^ Poran A, Nötzel C, Aly O, Mencia-Trinchant N, Harris CT, Guzman ML, et al. (Listopad 2017). "Single-cell RNA sequencing reveals a signature of sexual commitment in malaria parasites". Příroda. 551 (7678): 95–99. Bibcode:2017Natur.551...95P. doi:10.1038/nature24280. PMC  6055935. PMID  29094698.
  75. ^ Gasch AP, Yu FB, Hose J, Escalante LE, Place M, Bacher R, et al. (Prosinec 2017). Balaban N (ed.). "Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress". PLOS Biology. 15 (12): e2004050. doi:10.1371/journal.pbio.2004050. PMC  5746276. PMID  29240790.
  76. ^ Kang Y, Norris MH, Zarzycki-Siek J, Nierman WC, Donachie SP, Hoang TT (June 2011). "Transcript amplification from single bacterium for transcriptome analysis". Výzkum genomu. 21 (6): 925–35. doi:10.1101/gr.116103.110. PMC  3106325. PMID  21536723.
  77. ^ Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R, et al. (Srpen 2017). "Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism". Věda. 357 (6352): 661–667. Bibcode:2017Sci...357..661C. doi:10.1126/science.aam8940. PMC  5894354. PMID  28818938.
  78. ^ Plass M, Solana J, Wolf FA, Ayoub S, Misios A, Glažar P, et al. (Květen 2018). "Cell type atlas and lineage tree of a whole complex animal by single-cell transcriptomics". Věda. 360 (6391): eaaq1723. doi:10.1126/science.aaq1723. PMID  29674432.
  79. ^ Fincher CT, Wurtzel O, de Hoog T, Kravarik KM, Reddien PW (May 2018). "Schmidtea mediterranea". Věda. 360 (6391): eaaq1736. doi:10.1126/science.aaq1736. PMC  6563842. PMID  29674431.
  80. ^ Gerber, Tobias; Murawala, Prayag; Knapp, Dunja; Masselink, Wouter; Schuez, Maritta; Hermann, Sarah; Gac-Santel, Malgorzata; Nowoshilow, Sergej; Kageyama, Jorge; Khattak, Shahryar; Currie, Joshua D. (2018-10-26). "Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration". Věda. 362 (6413): eaaq0681. Bibcode:2018Sci...362..681G. doi:10.1126/science.aaq0681. ISSN  0036-8075. PMC  6669047. PMID  30262634.
  81. ^ Leigh, Nicholas D.; Dunlap, Garrett S.; Johnson, Kimberly; Mariano, Rachelle; Oshiro, Rachel; Wong, Alan Y.; Bryant, Donald M.; Miller, Bess M.; Ratner, Alex; Chen, Andy; Ye, William W. (2018-12-04). "Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution". Příroda komunikace. 9 (1): 5153. Bibcode:2018NatCo...9.5153L. doi:10.1038/s41467-018-07604-0. ISSN  2041-1723. PMC  6279788. PMID  30514844.
  82. ^ Wagner DE, Weinreb C, Collins ZM, Briggs JA, Megason SG, Klein AM (June 2018). "Single-cell mapping of gene expression landscapes and lineage in the zebrafish embryo". Věda. 360 (6392): 981–987. Bibcode:2018Sci...360..981W. doi:10.1126/science.aar4362. PMC  6083445. PMID  29700229.
  83. ^ Farrell JA, Wang Y, Riesenfeld SJ, Shekhar K, Regev A, Schier AF (June 2018). "Single-cell reconstruction of developmental trajectories during zebrafish embryogenesis". Věda. 360 (6392): eaar3131. doi:10.1126/science.aar3131. PMC  6247916. PMID  29700225.
  84. ^ Zafar H, Lin C, Bar-Joseph Z (June 2020). "Single-cell lineage tracing by integrating CRISPR-Cas9 mutations with transcriptomic data". Příroda komunikace. 3055 (1): 3055. Bibcode:2020NatCo..11.3055Z. doi:10.1038/s41467-020-16821-5. PMC  7298005. PMID  32546686.
  85. ^ Briggs JA, Weinreb C, Wagner DE, Megason S, Peshkin L, Kirschner MW, Klein AM (June 2018). "The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution". Věda. 360 (6392): eaar5780. doi:10.1126/science.aar5780. PMC  6038144. PMID  29700227.
  86. ^ You J. "Science's 2018 Breakthrough of the Year: tracking development cell by cell". Vědecký časopis. Americká asociace pro rozvoj vědy.
  87. ^ Zong C, Lu S, Chapman AR, Xie XS (December 2012). "Detekce celého nukleomu jednonukleotidů a variací počtu kopií jedné lidské buňky". Věda. 338 (6114): 1622–6. Bibcode:2012Sci...338.1622Z. doi:10.1126 / science.1229164. PMC  3600412. PMID  23258894.
  88. ^ Kurimoto K, Yabuta Y, Ohinata Y, Saitou M (2007). "Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis". Přírodní protokoly. 2 (3): 739–52. doi:10.1038/nprot.2007.79. PMID  17406636. S2CID  7404545.
  89. ^ Yachida S, Jones S, Bozic I, Antal T, Leary R, Fu B, et al. (Říjen 2010). "Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer". Příroda. 467 (7319): 1114–7. Bibcode:2010Natur.467.1114Y. doi:10.1038/nature09515. PMC  3148940. PMID  20981102.
  90. ^ Frumkin D, Wasserstrom A, Itzkovitz S, Harmelin A, Rechavi G, Shapiro E (February 2008). "Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues". BMC biotechnologie. 8 (17): 17. doi:10.1186/1472-6750-8-17. PMC  2266725. PMID  18284708.
  91. ^ Dalerba P, Kalisky T, Sahoo D, Rajendran PS, Rothenberg ME, Leyrat AA, et al. (Listopad 2011). "Single-cell dissection of transcriptional heterogeneity in human colon tumors". Přírodní biotechnologie. 29 (12): 1120–7. doi:10.1038/nbt.2038. PMC  3237928. PMID  22081019.
  92. ^ White AK, VanInsberghe M, Petriv OI, Hamidi M, Sikorski D, Marra MA, et al. (Srpen 2011). "High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR". Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 108 (34): 13999–4004. Bibcode:2011PNAS..10813999W. doi:10.1073/pnas.1019446108. PMC  3161570. PMID  21808033.