Spike-in RNA - RNA spike-in

Trojrozměrný struktura z RNA molekula. Spike-iny RNA jsou krátké syntetický RNA polymery.

An Spike-in RNA je Přepis RNA známých sekvence a Množství zvyklý kalibrovat měření v RNA hybridizační testy, jako DNA microarray experimenty, RT-qPCR, a RNA-sekv.[1]

Spike-in je navržen tak, aby se spojil s a DNA molekula s a odpovídající sekvence, známý jako a řízení sonda.[2][3][4] Tento proces specifické vazby se nazývá hybridizace. Známé množství RNA spike-in je smícháno s experimentálním vzorkem během přípravy.[2] Stupeň hybridizace mezi špičkami a kontrolními sondami je zvyklý normalizovat hybridizační měření vzorku RNA.[2]

Dějiny

Nukleová kyselina hybridizační testy se používají po celá desetiletí k detekci specifických sekvencí DNA nebo RNA,[5] s prekurzorem DNA microarray používaným již v roce 1965.[6] V takových testech pozitivní kontrola oligonukleotidy jsou nezbytné k poskytnutí standardu pro srovnání koncentrace cílové sekvence a ke kontrole a opravě nespecifická vazba; tj. náhodné navázání RNA nakomplementární DNA sekvence.[7] Tyto ovládací prvky se staly známými jako „spike-ins“.[1] S příchodem čipů microarray DNA v 90. letech[8] a komercializace společnosti vysoce výkonné metody pro sekvenování a testy detekce RNA začali výrobci „souprav“ hybridizačních testů poskytovat předem vyvinuté špičky.[1] V případě genová exprese testovací mikročipy nebo Sekvenování RNA (RNA-seq), jsou použity RNA spike-ins.

Výrobní

Hlavní článek: Syntéza oligonukleotidů

Spike-iny RNA lze syntetizovat jakýmkoli způsobem vytváření RNA synteticky, nebo pomocí buněk k přepsat DNA na RNA in vivo (v buňkách).[1] Lze vyrobit RNA in vitro (bez buněk) pomocí RNA polymeráza a DNA s požadovanou sekvencí.[1] Velké měřítko biotech výrobci vyrábějí RNA synteticky pomocí technik s vysokou propustností a poskytují řešení spike-inů RNA v předem stanovené koncentraci.[1] Bakterie obsahující DNA (obvykle na plazmidy ) pro přepis do spike-ins jsou také komerčně dostupné.[1] Purifikovaná RNA může být dlouhodobě skladována v a pufrované řešení při nízké teplotě.[1]

Aplikace

Příklad údajů z DNA microarray. Světlé skvrny ukazují místa, kde došlo k hybridizaci, což naznačuje, že ve vzorku byla přítomna RNA odpovídající sekvence.

DNA mikročipy

Hlavní článek: DNA microarray

DNA mikročipy jsou pevný povrchy, obvykle malý čip, ke kterému je krátká DNA polymery známé sekvence jsou kovalentně vázán.[6] Když vzorek neznámé RNA protéká maticí, RNA báze se spáruje s a váže se na komplementární DNA.[6] Lze detekovat vázané transkripty, což naznačuje přítomnost RNA s odpovídající sekvencí.[6] Testy DNA microarray jsou užitečné při studiích genová exprese, protože mnoho z mRNA transkriptů přítomných v buňce může být detekováno současně.[6] RNA špičky-iny známého množství mohou poskytnout základní linii signál pro srovnání se signálem z transkriptů neznámé veličiny, takže data mohou být normalizována v poli a mezi různými poli.[2]

Sekvenování

Hlavní článek: RNA-sekv

Sekvenování RNA (RNA-Seq) se provádí pomocí reverzní přepis RNA do komplementární DNA (cDNA) a vysoce výkonné sekvenování cDNA.[9] Takové vysoce výkonné metody mohou být náchylné k chybám a pro detekci a opravu úrovní chyb jsou nezbytné známé ovládací prvky.[9] Kontroly špičky RNA mohou poskytnout míru citlivosti a specificity experimentu RNA-Seq.[9]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C d E F G h Yang IV (2006). Použití externích ovládacích prvků v experimentech s microarray. Metody Enzymol. Metody v enzymologii. 411. 50–63. doi:10.1016 / S0076-6879 (06) 11004-6. ISBN  9780121828165. PMID  16939785.
  2. ^ A b C d Fardin P, Moretti S, Biasotti B, Ricciardi A, Bonassi S, Varesio L (2007). "Normalizace microarray s nízkou hustotou pomocí externích ovládacích prvků s hroty: analýza profilu exprese buněčných linií makrofágů". BMC Genomics. 8: 17. doi:10.1186/1471-2164-8-17. PMC  1797020. PMID  17229315.
  3. ^ Wilkes T, Laux H, Foy CA (2007). "Kvalita dat microarray - přehled současného vývoje". OMICS. 11 (1): 1–13. doi:10.1089 / omi.2006.0001. PMID  17411392.
  4. ^ Schuster EF, Blanc E, Partridge L, Thornton JM (2007). „Odhad a oprava nespecifické vazby ve velkém experimentu se špičkami“. Genome Biol. 8 (6): R126. doi:10.1186 / gb-2007-8-6-r126. PMC  2394775. PMID  17594493.
  5. ^ Southern, Edwin M. (2001). „DNA Microarrays: History and Overview“. Pole DNA. Metody v molekulární biologii ™. 170. Humana Press. str.1–15. doi:10.1385/1-59259-234-1:1. ISBN  9780896038226. PMID  11357674.
  6. ^ A b C d E Gillespie, D .; Spiegelman, S. (červenec 1965). „Kvantitativní stanovení hybridů DNA-RNA s imobilizovanou DNA na membráně“. Journal of Molecular Biology. 12 (3): 829–842. doi:10.1016 / s0022-2836 (65) 80331-x. ISSN  0022-2836. PMID  4955314.
  7. ^ Yang, Ivana V. (01.01.2006). "[4] Použití externích ovládacích prvků v experimentech s mikročipy". Metody v enzymologii. Metody v enzymologii. DNA mikročipy, část B: Databáze a statistika. 411. Akademický tisk. 50–63. doi:10.1016 / S0076-6879 (06) 11004-6. ISBN  9780121828165. PMID  16939785.
  8. ^ Schena, Mark; Shalon, Dari; Davis, Ronald W .; Brown, Patrick O. (1995-10-20). "Kvantitativní sledování vzorů genové exprese pomocí doplňkové DNA microarray". Věda. 270 (5235): 467–470. doi:10.1126 / science.270.5235.467. ISSN  0036-8075. PMID  7569999.
  9. ^ A b C Jiang, Lichun; Schlesinger, Felix; Davis, Carrie A .; Zhang, Yu; Li, Renhua; Salit, Marc; Gingeras, Thomas R .; Oliver, Brian (01.09.2011). "Syntetické špendlíkové standardy pro RNA-seq experimenty". Výzkum genomu. 21 (9): 1543–1551. doi:10.1101 / gr.121095.111. ISSN  1088-9051. PMC  3166838. PMID  21816910.