Číslo integrity RNA - RNA integrity number - Wikipedia

The Číslo integrity RNA (RIN) je algoritmus pro přiřazování hodnot integrity RNA Měření.

Integrita RNA je velkým problémem genová exprese studií a tradičně byla hodnocena pomocí 28S na 18S rRNA poměr, metoda, která se ukázala jako nekonzistentní.[1] Tato nekonzistence vzniká, protože pro srovnání 28S a 18S je nezbytná subjektivní lidská interpretace gel snímky. K překonání tohoto problému byl navržen algoritmus RIN. Algoritmus RIN se aplikuje na elektroforetická měření RNA, typicky získaná pomocí kapilární gelové elektroforézy, a je založena na kombinaci různých funkcí, které přispívají informacemi o integritě RNA a poskytují univerzálnější měřítko. RIN bylo prokázáno, že je robustní a reprodukovatelný ve studiích porovnávajících jej s jinými algoritmy výpočtu integrity RNA, což upevňuje jeho pozici jako preferované metody určování kvality RNA, která má být analyzována.[2]

Hlavní kritika vůči RIN je při použití s ​​rostlinami nebo při studiích interakcí eukaryoticko-prokaryotických buněk. Algoritmus RIN není schopen rozlišit eukaryotický /prokaryotický /chloroplast ribozomální RNA, což v takových situacích vytváří vážné podhodnocení indexu kvality.

Terminologie

Elektroforéza je proces oddělování nukleová kyselina druhy na základě jejich délky působením elektrického pole na ně. Jelikož jsou nukleové kyseliny negativně nabité, jsou tlačeny elektrickým polem přes matici, obvykle an agaróza gel, přičemž menší molekuly jsou tlačeny dále a rychleji.[3] Kapilární elektroforéza je technika, při které může být malé množství vzorku nukleové kyseliny naneseno na gel ve velmi tenké zkumavce. Ve stroji je detektor, který dokáže zjistit, kdy vzorky nukleové kyseliny procházejí specifickým bodem ve zkumavce, přičemž menší vzorky procházejí jako první. To může vytvořit elektroferogram, jako je ten na obrázku 1, kde délka souvisí s dobou, po kterou vzorky projdou detektorem.

Značka je vzorek známé velikosti, který běží spolu se vzorkem, takže skutečná velikost zbytku vzorku může být známa porovnáním jejich běžecké vzdálenosti / času vzhledem k této značce.

RNA je biologická makromolekula z cukrů a dusíkaté báze který hraje řadu rozhodujících rolí ve všech živých buňkách. Existuje několik podtypů RNA, přičemž nejvýznamnější jsou v buňce tRNA (přenosová RNA), rRNA (ribozomální RNA) a mRNA (messenger RNA). Všichni tři jsou zapojeni do procesu překlad, přičemž nejvýznamnějším druhem (~ 85%) buněčné RNA je rRNA. Ve výsledku se jedná o nejviditelnější druh, když se RNA analyzuje elektroforézou a používá se tedy ke stanovení kvality RNA (viz Výpočet níže). rRNA se dodává v různých velikostech, přičemž u savců patří do velikostí 5S, 18S a 28S. 28S a 5S rRNA tvoří velkou podjednotku a 18S tvoří malou podjednotku ribozom, molekulární aparát odpovědný za syntézu proteinů.[4]

Aplikace

RNázy jsou všudypřítomné a často mohou kontaminovat a následně degradovat vzorky RNA v laboratoři, takže integritu RNA lze velmi snadno narušit, což vede k řadě laboratorních technik určených k eliminaci jejich dopadu.[5][6] Tyto metody však nejsou bláznivé, takže vzorky lze stále degradovat, což vyžaduje metodu měření integrity RNA, aby se zajistila důvěryhodnost a reprodukovatelnost molekulárních testů, protože integrita RNA je zásadní pro správné výsledky studií genové exprese, jako je například analýza microarray, Northern blot, nebo kvantitativní real-time PCR (qPCR).[7][8] RNA, která byla degradována, má přímý dopad na vypočtené úrovně exprese, což často vede k významnému snížení zjevné exprese.[9]

qPCR a podobné techniky jsou velmi nákladné a vyžadují značnou část času i peněz, takže je prováděn další výzkum s cílem snížit náklady při zachování přesnosti a reprodukovatelnosti qPCR pro genovou expresi a další aplikace.[10] Hodnocení RIN umožňuje vědci vyhodnotit důvěryhodnost a reprodukovatelnost experimentu, než vzniknou značné náklady při provádění studií genové exprese.

RIN je standardní metoda měření integrity RNA a lze ji použít k vyhodnocení kvality RNA produkované novými technikami izolace RNA.[11]

Rozvoj

Protože je již dlouho známo, že integrita RNA je problémem ve studiích molekulární biologie, existuje několik metod, které se historicky používaly ke stanovení integrity RNA. Nejoblíbenější je již dlouho elektroforéza na agarózovém gelu ethidiumbromid barvení, což umožňuje jednomu vizualizovat pásy z píku rRNA. Výšku pásů 28S a 18S lze navzájem srovnávat, přičemž poměr 2: 1 indikuje nedegradovanou RNA.[1] I když je tato metoda velmi levná a snadná, existuje několik problémů s touto metodou, zejména s její subjektivitou, což vede k nekonzistentním, nestandardizovaným hodnocením kvality RNA a velkému množství RNA, které je nutné k její vizualizaci na agarózovém gelu může být problematické, pokud s RNA není moc práce.[1][12] Existuje také řada různých problémů, které mohou vzniknout elektroforézou na agarózovém gelu, jako je špatné naplnění, nerovnoměrný běh a nerovnoměrné barvení, které vedou ke zvýšené variabilitě v přesnosti použití elektroforézy na agarózovém gelu ke stanovení integrity RNA.[13]

Číslo integrity RNA bylo vyvinuto společností Agilent Technologies[Citace je zapotřebí ]. Algoritmus byl generován odebráním stovek vzorků a tím, že jim specialisté ručně přiřadili hodnotu 1 až 10 na základě jejich integrity, přičemž 10 je nejvyšší. Adaptivní výukové nástroje využívající a Bayesovské učení Tato technika byla použita ke generování algoritmu, který dokáže předpovědět RIN, převážně pomocí funkcí uvedených níže v části „Výpočet“.[1][14] To umožňuje veškerému softwaru Agilent produkovat stejný RIN pro daný vzorek RNA, což standardizuje měření a činí ho mnohem méně subjektivním než dřívější metody[Citace je zapotřebí ].

Výpočet

Obrázek 1. Idealizovaná stopa elektroferogramu, která by měla RIN přibližně 10. Napravo je příklad toho, jak by vypadání běhu vzorku buněčné RNA vypadalo v jednom pruhu agarózového gelu. Nalevo je označená idealizovaná verze stopy elektroforogramu, kterou by takový gel mohl vytvořit. Ve skutečném elektroferogramu by bylo mnoho malých vrcholů, zejména v rychlé oblasti odpovídající mRNA, ale ty nebyly zahrnuty kvůli jasnosti.
Obrázek 2. Idealizovaná stopa elektroferogramu, která by měla RIN přibližně 1 nebo 2. Na rozdíl od obrázku 1, kde jsou vrcholy 28S a 18S velmi velké, zde se zmenšily a většina vzorku je místo toho vlevo, blíže k místu, kde značka původně byla. Průměrná velikost RNA se jasně zmenšila, což naznačuje nekvalitní RNA.

RIN pro vzorek se počítá pomocí několika charakteristik stopy elektroforogramu RNA, přičemž první dva uvedené níže jsou nejvýznamnější. RIN přiřadí elektroferogramu hodnotu od 1 do 10, přičemž 10 je nejméně degradovaný. Všechny následující popisy platí pro savčí RNA, protože RNA u jiných druhů mají různé velikosti rRNA:[1]Poměr celkové RNA se vypočítá z poměru plochy pod vrcholy 18S a 28S rRNA k celkové ploše pod grafem, zde je žádoucí velké množství, což naznačuje, že velká část rRNA je stále v těchto velikostech, a tedy malá až žádná došlo k degradaci. Ideální poměr lze vidět na obrázku 1, kde téměř veškerá RNA je v píku RNA 18S a 28S.

Pro výšku vrcholu 28S je požadována velká hodnota. 28S, nejvýznamnější druh rRNA, se používá při výpočtu RIN, protože je typicky degradován rychleji než 18S rRNA, a tak měření jeho výšky píku umožňuje detekci raných stadií degradace. To je opět vidět na obrázku 1, kde je vrchol 28S největší, a tak je to dobré.

Rychlá oblast je oblast mezi píky 18S a 5S rRNA na elektroforogramu. Zpočátku, jak se zvyšuje hodnota poměru rychlých oblastí, indikuje to degradaci 18S a 28S rRNA na střední velikost, ačkoli se poměr postupně snižuje, jak se RNA degraduje dále, na ještě menší velikosti. Nízká hodnota tedy nemusí nutně znamenat dobrou nebo špatnou integritu RNA.

Je požadována malá výška markeru, což naznačuje, že byla degradována pouze malá množství RNA a pokračovala do nejmenších délek, označených krátkým markerem. Pokud se zde najde velké množství, znamená to, že velká množství rRNA byla degradována na malé kousky, které by byly nalezeny blíže k tomuto markeru. Tuto situaci lze vidět na „nekvalitním“ elektroferogramu RNA na obrázku 2, kde je výška píku nad markerem (zcela vlevo) velmi velká, takže RNA byla značně degradována. V prokaryotických vzorcích je algoritmus poněkud odlišný, ale software Agilent 2100 Bioanalyzer Expert je nyní schopen vypočítat RIN i pro prokaryotické vzorky.[15] Rozdíl pravděpodobně vyplývá ze skutečnosti, že zatímco vzorky savců mají jako svůj převládající druh ribosomální RNA 28S a 18S, prokaryotické RNA mají velikost posunutou o něco menší, na 23S a 16S, takže k tomu musí být posunut algoritmus. Dalším zásadním faktem při výpočtu čísel integrity prokaryotické RNA je, že RIN nebyl validován v rozsahu, který má pro eukaryotickou RNA.[15] Ukázalo se, že vyšší hodnoty RIN korelují s lepšími následnými výsledky u eukaryot, ale u prokaryot to nebylo provedeno tak extenzivně, takže to u prokaryot může znamenat méně.

Tyto elektroferogramy pro výpočet RIN se provádějí pomocí přístroje Agilent Bioanalyzer, který je schopen provádět elektroforézu a generovat elektroferogramy.[14] Software Agilent 2100 je jedinečně schopen provádět software RIN, protože přesný algoritmus je proprietární, takže při jeho výpočtu jsou použity další důležité funkce elektroforogramu RNA, které nejsou veřejně dostupné.

Reference

  1. ^ A b C d E Schroeder, Andreas; Mueller, Odilo; Stocker, Susanne; Salowsky, Ruediger; Leiber, Michael; Gassmann, Marcus; Lightfoot, Samar; Menzel, Wolfram; Granzow, Martin; Ragg, Thomas (2006). „RIN: číslo integrity RNA pro přiřazení hodnot integrity k měření RNA“. BMC Molekulární biologie. 7 (1): 3. doi:10.1186/1471-2199-7-3. PMC  1413964. PMID  16448564.
  2. ^ Imbeaud, Sandrine; Graudens, Esther; Boulanger, Virginie; Barlet, Xavier; Zaborski, Patrick; Eveno, Eric; Mueller, Odilo; Schroeder, Andreas; Auffray, Charles (01.01.2005). „Směrem ke standardizaci hodnocení kvality RNA pomocí uživatelsky nezávislých klasifikátorů stop mikrokapilární elektroforézy“. Výzkum nukleových kyselin. 33 (6): e56. doi:10.1093 / nar / gni054. ISSN  0305-1048. PMC  1072807. PMID  15800207.
  3. ^ Watson, James D .; Baker, Tania A .; Bell, Stephen P .; Gann, Alexander; Levine, Michael; Losick, Richard (2014). Molekulární biologie genu: Sedmé vydání. Glenview, IL: Pearson Education. ISBN  978-0-321-85149-9.
  4. ^ Khatter, Heena; Myasnikov, Alexander G .; Natchiar, S. Kundhavai; Klaholz, Bruno P. (2015). "Struktura lidského 80S ribozomu". Příroda. 520 (7549): 640–645. Bibcode:2015 Natur.520..640K. doi:10.1038 / příroda14427. PMID  25901680. S2CID  4459012.
  5. ^ „Zabránění kontaminaci ribonukleázou | NEB“. www.neb.com. Citováno 2016-04-10.
  6. ^ „The Basics: RNase Control“. www.thermofisher.com. Citováno 2016-04-10.
  7. ^ Bustin, Stephen A .; Beneš, Vladimír; Garson, Jeremy A .; Hellemans, Jan; Huggett, Jim; Kubista, Mikael; Mueller, Reinhold; Nolan, Tania; Pfaffl, Michael W. (2009-04-01). „Pokyny MIQE: Minimální informace pro publikaci kvantitativních experimentů PCR v reálném čase“. Klinická chemie. 55 (4): 611–622. doi:10.1373 / clinchem.2008.112797. ISSN  0009-9147. PMID  19246619.
  8. ^ Fleige, Simone; Pfaffl, Michael W. (2006). „Integrita RNA a vliv na výkon QRT-PCR v reálném čase“. Molekulární aspekty medicíny. 27 (2–3): 126–139. doi:10.1016 / j.mam.2005.12.003. PMID  16469371.
  9. ^ Taylor, Sean C .; Mrkusich, Eli M. (2014). „Stav RT-kvantitativní PCR: Pozorování implementace minimálních informací pro publikaci kvantitativních experimentů PCR v reálném čase (MIQE) z první ruky“. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 24 (1): 46–52. doi:10.1159/000356189. PMID  24296827.
  10. ^ Reitschuler, Christoph; Lins, Philipp; Illmer, Paul (2014). „Vyhodnocení a přizpůsobení primeru pro nákladově efektivní QBRP na bázi SYBR Green a jeho použitelnost pro konkrétní kvantifikaci methanogenů“. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 30 (1): 293–304. doi:10.1007 / s11274-013-1450-x. PMID  23918633. S2CID  36790110.
  11. ^ Livingston, Whitney S .; Rusch, Heather L .; Nersesian, Paula V .; Baxter, Tristin; Mysliwiec, Vincent; Gill, Jessica M. (01.01.2015). „Vylepšený spánek vojenského personálu je spojen se změnami v expresi zánětlivých genů a zlepšením symptomů deprese“. Hranice v psychiatrii. 6: 59. doi:10.3389 / fpsyt.2015.00059. PMC  4415307. PMID  25983695.
  12. ^ Taylor, Sean; Wakem, Michael; Dijkman, Greg; Alsarraj, Marwan; Nguyen, Marie (01.04.2010). „Praktický přístup k RT-qPCR - publikování dat, která odpovídají směrnicím MIQE“. Metody. Probíhající vývoj qPCR. 50 (4): S1 – S5. doi:10.1016 / j.ymeth.2010.01.005. PMID  20215014.
  13. ^ „Pokrok v metodice kontroly kvality k hodnocení izolované celkové RNA a generované fragmentované cRNA“, Agilent Application Note, publikace číslo 5988-9861EN, 2003.
  14. ^ A b „RNA Integrity Number (RIN) - Standardization of RNA Quality Control“, Aplikační poznámka společnosti Agilent, číslo publikace 5989-1165EN, 2016.
  15. ^ A b Bioanalyzátor Agilent 2100: Uživatelská příručka 2100 Expert. Waldbronn, Německo: Agilent Technologies (2005).

externí odkazy