Knihovna (biologie) - Library (biology)

Mutageneze saturace místa je typ místně zaměřená mutageneze. Tento obrázek ukazuje saturační mutagenezi jedné polohy v teoretickém 10-zbytkovém proteinu. Verze proteinu divokého typu je zobrazena nahoře, přičemž M představuje první aminokyselinu methionin a * představuje ukončení translace. Všech 19 mutantů isoleucinu v poloze 5 je uvedeno níže.

Jak DNA knihovny generované náhodná mutageneze prostor pro ukázkovou sekvenci. Je zobrazena aminokyselina substituovaná do dané polohy. Každá tečka nebo sada propojených teček je jedním členem knihovny. PCR náchylná k chybám náhodně mutuje některé zbytky na jiné aminokyseliny. Alaninové skenování nahrazuje každý zbytek proteinu alaninem jeden po druhém. Sytost stránek nahrazuje každou z 20 možných aminokyselin (nebo některé jejich podskupiny) na jedné pozici, jednu po druhé.

v molekulární biologie, a knihovna je sbírka fragmentů DNA, která je skladována a šířena v populaci mikroorganismů procesem molekulární klonování. Existují různé typy knihoven DNA, včetně cDNA knihovny (vytvořeno z reverzně transkribovaná RNA ), genomové knihovny (vytvořené z genomové DNA) a randomizované knihovny mutantů (vytvořené syntézou genů de novo, kde jsou začleněny alternativní nukleotidy nebo kodony). Technologie knihovny DNA je oporou proudu molekulární biologie, genetické inženýrství, a proteinové inženýrství a aplikace těchto knihoven závisí na zdroji původních fragmentů DNA. Existují rozdíly v klonovací vektory a techniky používané při přípravě knihovny, ale obecně je každý fragment DNA jednoznačně vložen do klonovacího vektoru a soubor rekombinantní molekuly DNA je poté přenesen do populace bakterie (A Bakteriální umělý chromozom nebo BAC knihovna) nebo kvasinky, takže každý organismus obsahuje v průměru jeden konstrukt (vektor + inzert). Jak se populace organismů pěstuje v kultuře, molekuly DNA v nich obsažené se kopírují a množí (tedy „klonují“).

Terminologie

Termín "knihovna" se může vztahovat na populaci organismů, z nichž každý nese molekulu DNA vloženou do klonovacího vektoru, nebo alternativně ke shromažďování všech molekul klonovaného vektoru.

cDNA knihovny

A cDNA knihovna představuje vzorek mRNA purifikován z konkrétního zdroje (buď ze souboru buněk, určité tkáně nebo celého organismu), který byl pomocí enzymu převeden zpět na šablonu DNA reverzní transkriptáza. Představuje tedy geny, které byly aktivně transkribovány v daném zdroji za fyziologických, vývojových nebo environmentálních podmínek, které existovaly při čištění mRNA. cDNA knihovny lze generovat pomocí technik, které podporují klony „plné délky“ nebo za podmínek, které generují kratší fragmenty používané k identifikaci „vyjádřené značky sekvence ".

cDNA knihovny jsou užitečné v reverzní genetice, ale představují pouze velmi malou (méně než 1%) část celkového genomu v daném organismu.

Aplikace knihoven cDNA zahrnují:

Objev nových genů
Klonování molekul cDNA plné délky pro in vitro studium genové funkce
Studium repertoáru mRNA exprimovaných v různých buňkách nebo tkáních
Studie alternativní sestřih v různých buňkách nebo tkáních

Genomické knihovny

A genomová knihovna je sada klonů, které společně představují celý genom daného organismu. Počet klonů, které tvoří genomovou knihovnu, závisí na (1) velikosti daného genomu a (2) velikosti inzertu tolerované konkrétním klonovací vektor Systém. Pro většinu praktických účelů není zdroj tkáně genomové DNA důležitý, protože každá buňka těla obsahuje prakticky identickou DNA (až na některé výjimky).

Mezi aplikace genomových knihoven patří:

Stanovení úplné sekvence genomu daného organismu (viz genomový projekt )
Slouží jako zdroj genomové sekvence pro generování transgenní zvířata přes genetické inženýrství
Studium funkce regulační sekvence in vitro
Studie genetické mutace v rakovina papírové kapesníky

Knihovny syntetických mutantů

Znázornění jednoho běžného způsobu klonování místně zaměřené knihovny mutageneze (tj. Použití degenerovaných oligonukleotidů). Požadovaný gen je PCR s oligony, které obsahují oblast, která je dokonale komplementární s templátem (modrá), a oblastí, která se liší od templátu jedním nebo více nukleotidy (červená). Mnoho takových primerů obsahujících degeneraci v nekomplementární oblasti je spojeno do stejné PCR, což vede k mnoha různým produktům PCR s různými mutacemi v této oblasti (jednotlivé mutanty zobrazené níže různými barvami).

Na rozdíl od výše popsaných typů knihoven existuje řada umělých metod pro vytváření knihoven variantních genů.^[1] Variace v celém genu mohou být zavedeny náhodně kterýmkoli z nich PCR náchylná k chybám,^[2] DNA míchání rekombinovat dohromady části podobných genů,^[3] nebo metody založené na transposonu indels.^[4]Alternativně lze mutace zaměřit na specifické kodony během de novo syntéza nebo saturační mutageneze postavit jeden nebo více bodové mutanty genu kontrolovaným způsobem.^[5] To má za následek směs dvouřetězcových molekul DNA, které představují varianty původního genu.

The vyjádřený proteiny z těchto knihoven pak mohou být skrínovány na varianty, které vykazují příznivé vlastnosti (např. stabilitu, vazebnou afinitu nebo aktivitu enzymu). To lze opakovat v cyklech vytváření genových variant a skríningu expresních produktů v a řízená evoluce proces.^[1]

Přehled technik přípravy cDNA knihovny

Extrakce DNA

Pokud vytváříte knihovnu mRNA (tj. S klony cDNA), existuje několik možných protokolů pro izolaci mRNA plné délky. K extrakci DNA pro knihovny genomové DNA (také známé jako gDNA) může být užitečný mini-prep DNA.

Připravte přílohy

cDNA knihovny vyžadují péči, aby zajistily, že klony mRNA plné délky budou zachyceny jako cDNA (která bude později vložena do vektorů). Z tohoto důvodu bylo navrženo několik protokolů pro optimalizaci syntézy prvního řetězce cDNA a druhého řetězce cDNA a také pro zvýšení pravděpodobnosti směrového klonování do vektoru.

gDNA fragmenty jsou generovány z extrahované gDNA pomocí nespecifických častých restrikčních enzymů.

Vektory

Nukleotidové sekvence, které nás zajímají, jsou konzervovány jako inzerty do a plazmid nebo genom a bakteriofág který byl použit k infikování bakteriálních buněk.

Vektory se šíří nejčastěji v bakteriálních buňkách, ale pokud se používá YAC (kvasinkový umělý chromozom), lze použít kvasinkové buňky. Vektory by se mohly šířit také ve virech, ale to může být časově náročné a zdlouhavé. Vysoká účinnost transfekce dosažená použitím virů (často fágů) je však činí užitečnými pro zabalení vektoru (s ligovanou vložkou) a jejich zavedení do bakteriální (nebo kvasinkové) buňky.

Kromě toho byl pro knihovny cDNA vyvinut systém využívající fága Lambda Zap II, ExAssist a 2 druhy E. coli. Místo toho lze také použít systém Cre-Lox využívající loxP místa a in vivo expresi enzymu rekombinázy. Toto jsou příklady systémů excize in vivo. Excize in vitro zahrnuje subklonování často pomocí tradičních restrikčních enzymů a klonovacích strategií. Excize in vitro může být časově náročnější a může vyžadovat více praktických prací než systémy excize in vivo. V obou případech systémy umožňují pohyb vektoru z fága do živé buňky, kde se může vektor replikovat a šířit, dokud nebude použita knihovna.

Používání knihoven

Pracovní postup pro screening syntetické knihovny k identifikaci buněk produkujících sledovanou chemickou látku.

To zahrnuje „screening“ sledovaných sekvencí. Existuje několik možných metod, jak toho dosáhnout.

Reference

^ ^A ^b Wajapeyee, Narendra; Liu, Alex Y .; Forloni, Matteo (01.03.2018). "Náhodná mutageneze pomocí chybně náchylných DNA polymeráz". Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3): pdb.prot097741. doi:10.1101 / pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.
^ McCullum, Elizabeth O .; Williams, Berea A. R .; Zhang, Jinglei; Chaput, John C. (2010), Braman, Jeff (ed.), „Random Mutagenesis by Error-Prone PCR“, In Vitro Mutagenesis Protocols: Třetí vydání, Metody v molekulární biologii, Humana Press, 634, str. 103–109, doi:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN 9781607616528, PMID 20676978
^ Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (leden 1998). „DNA míchání rodiny genů z různých druhů urychluje řízenou evoluci“. Příroda. 391 (6664): 288–91. Bibcode:1998 Natur.391..288C. doi:10.1038/34663. PMID 9440693.
^ Jones DD (květen 2005). „Odstranění tripletových nukleotidů v náhodných pozicích v cílovém genu: tolerance TEM-1 beta-laktamázy k deleci aminokyseliny“. Výzkum nukleových kyselin. 33 (9): e80. doi:10.1093 / nar / gni077. PMC 1129029. PMID 15897323.
^ Wang, Tian-Wen; Zhu, Hu; Ma, Xing-Yuan; Zhang, Ting; Ma, Yu-Shu; Wei, Dong-Zhi (2006-09-01). "Konstrukce mutantní knihovny v řízené molekulární evoluci". Molekulární biotechnologie. 34 (1): 55–68. doi:10,1385 / MB: 34: 1: 55. ISSN 1559-0305. PMID 16943572.

externí odkazy

[:0-1] A ^b Wajapeyee, Narendra; Liu, Alex Y .; Forloni, Matteo (01.03.2018). "Náhodná mutageneze pomocí chybně náchylných DNA polymeráz". Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3): pdb.prot097741. doi:10.1101 / pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.

[2] McCullum, Elizabeth O .; Williams, Berea A. R .; Zhang, Jinglei; Chaput, John C. (2010), Braman, Jeff (ed.), „Random Mutagenesis by Error-Prone PCR“, In Vitro Mutagenesis Protocols: Třetí vydání, Metody v molekulární biologii, Humana Press, 634, str. 103–109, doi:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN 9781607616528, PMID 20676978

[3] Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (leden 1998). „DNA míchání rodiny genů z různých druhů urychluje řízenou evoluci“. Příroda. 391 (6664): 288–91. Bibcode:1998 Natur.391..288C. doi:10.1038/34663. PMID 9440693.

[4] Jones DD (květen 2005). „Odstranění tripletových nukleotidů v náhodných pozicích v cílovém genu: tolerance TEM-1 beta-laktamázy k deleci aminokyseliny“. Výzkum nukleových kyselin. 33 (9): e80. doi:10.1093 / nar / gni077. PMC 1129029. PMID 15897323.

[5] Wang, Tian-Wen; Zhu, Hu; Ma, Xing-Yuan; Zhang, Ting; Ma, Yu-Shu; Wei, Dong-Zhi (2006-09-01). "Konstrukce mutantní knihovny v řízené molekulární evoluci". Molekulární biotechnologie. 34 (1): 55–68. doi:10,1385 / MB: 34: 1: 55. ISSN 1559-0305. PMID 16943572.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]