Počáteční bod (droždí) - Start point (yeast)

Kontrolní bod Start je hlavní buněčný cyklus kontrolní bod v droždí. Kontrolní bod Start zajišťuje nevratný vstup do buněčného cyklu, i když se podmínky později stanou nepříznivými. Mezi fyziologické faktory, které kontrolují průchod kontrolním bodem Start, patří vnější koncentrace živin, přítomnost spojovacího faktoru / feromonu, formy stresu a kontrola velikosti.[1]

Včasná charakteristika začátku

Ve snaze studovat uspořádané události buněčného cyklu Leland Hartwell et al. testovány a charakterizovány teplotně citlivé mutanty, známé také jako mutanti cyklu buněčného dělení (mutanti cdc), které zobrazují zastavený buněčný vývoj v různých fázích cyklu.[2] Hartwell nejen identifikoval mutanta cdc28, který se zastaví ve velmi raných stádiích buněčného cyklu, ale také si uvědomil, že přítomnost faktorů páření může vést k podobným fenotypům inhibované tvorby pupenů a nedostatečné syntézy DNA. Zejména buňky, které byly vystaveny faktory páření v pozdějších fázích cyklu pokračovalo dělení a bylo zastaveno až poté, co výsledné dceřiné buňky dosáhly „raných stádií“ (nebo více technicky fáze G1) buněčný cyklus. Tyto výsledky naznačují, že jak cdc28, tak i pářící se feromony zprostředkovat takové rané události a dále naznačovat, že v buněčném cyklu existuje bod, kdy se buňka zaváže spíše k dělení než k páření. Hartwell pojmenoval tento bod „Start“, kde jsou buňky citlivé na páření feromonů před dosažením této fáze, ale necitlivé na faktory páření poté.

V letech následujících po Hartwellových pracných experimentech se ukázalo, že další faktory prostředí přispívají k buněčnému osudu v kvasinkách a analogicky v jiných organismech. Ačkoli to není specifické pro kvasinky, kritická studie předložená Zetterbergem et al. v roce 1985 poskytl důkazy o bodu závazku ve švýcarských buňkách 3T3 nebo myších embryonálních fibroblastech, když byly pěstovány v podmínkách bohatých na sérum nebo hladovějících v séru.[3] Stejně jako reakce na páření feromonů v Hartwellových experimentech nebyla odpověď na hladovění v séru u všech buněk jednotná. Pouze postmitotické buňky mladší než tři hodiny zastavily buněčné dělení za těchto podmínek, zatímco buňky starší než čtyři hodiny byly necitlivé na nepřítomnost růstových faktorů. Tyto experimentální výsledky ukazují silné důkazy o vstupu do závazku mitóza, a následně naznačují, že buňka je schopna snímat své prostředí pro narážky jako růstové faktory před spácháním.

Přepis genů G1 / S

Transkripce několika genů G1 / S je nezbytná pro to, aby buňky mohly procházet buněčným cyklem. U začínajících kvasinek je aktivována transkripce více než 200 genů při přechodu G1 / S.[4]Transkripce těchto genů G1 / S je primárně regulována dvěma regulačními proteiny genů, SBF a MBF. Tyto regulační proteiny tvoří komplexy s SCB, respektive MCB, které jsou umístěny na promotorech genů G1 / S.[1]

Regulační proteiny SBF a MBF

Komplexy SBF a MBF jsou schopné aktivovat transkripci G1 / S pouze v případě, že je inhibitorový protein známý jako Whi5 je disociován. Disociace Whi5 vyžaduje fosforylaci Cln3-Cdk1 komplex.[1] To naznačuje, že aktivita Cln3-Cdk1 hraje důležitou roli v kontrolním bodě Start, protože je nutné současně aktivovat proteiny SBF i MBF. Činnost Cln3 koreluje s rychlostí růstu buněk.[1]

Aktivace S-Cdks pomocí G1 / S-Cdks

Geny G1 / S zahrnují cykliny Cln1 a Cln2, které mohou tvořit aktivní komplexy s Cdk1. Tyto aktivované komplexy Cln-Cdk pomáhají aktivovat komplexy S-Cdk, které jsou normálně inhibovány Sic1.[1] Sic1 nemá žádný účinek na komplexy Cln-Cdk. Komplexy Cln-Cdk aktivují komplexy S-Cdk zničením Sic1 podle fosforylace a následující SCF ubikvitinace.

Faktor páření / feromon

Interakce proteinů mezi cestou páření a progresí buněčného cyklu

Reakce na páření feromonů, jak je popsáno v Hartwellových experimentech [2] není překvapivé vzhledem k antagonistickým biochemickým interakcím mezi pářící se cestou a G1 cykliny, které podporují progresi buněčného cyklu.

Jak je znázorněno na přiloženém obrázku,[5] spojovací dráha sestává z kaskády MAPK (mitogenem aktivovaná protein kináza), kde Ste5 zprostředkovává feromonový signál a následné kinázové odpovědi pomocí Stell, Ste7 a Fus3. Z následných účinků a dokonce i okamžitých účinků Fus3 nakonec aktivuje Far1, který přímo inhibuje aktivitu G1 cyklinů, Cln1 / 2.

Cln1 / 2 zase přímo inhibuje spojovací dráhu prostřednictvím inhibice Far1 a Ste5. Aktivita Cln1 / 2 je zprostředkována aktivací upstream G1 cyklinu, Cln3. Cln3 spolu s cyklin-dependentní kinázou Cdc28 deaktivuje a podporuje export jaderné Whi5. Export Whi5 vede k částečné aktivaci transkripčních faktorů SBF a MBF, které nakonec podporují progresi buněčného cyklu. Tyto transkripční faktory podporují expresi Cln1 / 2 a zvyšují reakci buněčného cyklu vytvořením smyčky pozitivní zpětné vazby, protože Cln1 / 2 podporuje aktivaci SBF a export Whi5.

Kvantitativní popis začátku

Dnešní studie popisující vztah mezi zástavou páření a progresí buněčného cyklu navrhli Doncic et al. v červnu 2011.[5] Autoři si uvědomili, že množství jaderného Whi5 je indikátorem aktivity cyklinu G1, a proto se rozhodli kvantitativně porozumět bodu, ve kterém se buňky zavázaly k dělení. S mikrofluidní platformou byla asynchronní populace buněk vystavena feromonu, alfa-faktoru. Pomocí fúzního proteinu Whi5-GFP sledovali množství jaderného Whi5 po přidání alfa-faktoru a zjistili, zda je buňka zastavena nebo pokračuje v dělení. Podle očekávání buňky před spuštěním zastavily buněčné dělení po přidání feromonů, jak naznačuje malá část exportu Whi5. Naopak buňky po spuštění byly necitlivé na alfa-faktor a pokračovaly v dělení, což se odráželo ve velké části exportu Whi5. Diferenciální odpověď na přítomnost feromonů se tedy odráží v tom, zda je buňka pre- nebo post-Start, stavy, které lze charakterizovat tím, kolik Whi5 je přítomno v jádře. Logistická regrese byla dále použita k výpočtu pravděpodobnosti zatčení ve vztahu k frakci exportovaného Whi5 a ukázala ostrý přechod mezi zatčením a progresí, když bylo přibližně 50% Whi5 exportováno z jádra. Ukázalo se také, že tento podíl exportovaného Whi5 odpovídá aktivaci smyčky pozitivní zpětné vazby Cln1 / 2 (viz níže). Závěrem to znamená, že tento Start je definován aktivací zpětnovazební smyčky Cln1 / 2.

Role Whi5 v progresi buněčného cyklu

Jak bylo uvedeno výše, cykliny G1, Cln1 / 2, jsou součástí smyčky pozitivní zpětné vazby, která podporuje jejich vlastní transkripci a aktivaci transkripčních faktorů SBF a MBF. V roce 2008 Skotheim et al. navrhl, že tato zpětnovazební smyčka umožňuje silný signál zavázat se k buněčnému dělení geny regulovanými SBF a MBF.[4] Předpokládali, že bez koherentní exprese genů nezbytných pro časné události, jako je replikace DNA a tvorba pupenů, vytvářejí náhodné jednotlivé buněčné signály šum, který oslabuje odezvu závazku. Skotheim et al. Zaznamenali dlouhé a asynchronní indukční časy CLN2 a RAD27 (gen v regulonu SBF / MBF) v cln1ncln2∆ buňkách ve srovnání s divokým typem. tedy dospěl k závěru, že mechanismus pozitivní zpětné vazby Cln1 / 2 umožňuje synchronní a efektivnější expresi regulonu SBF / MBF.

Autoři dále zjistili, že v této pozitivní zpětné vazbě hraje roli fosforylace Whi5 a následná inaktivace. Alela Whi5 postrádající šest z dvanácti fosforylačních míst vede k pomalému výstupu z jádra a v důsledku toho k méně koherentní indukci exprese CLN2 a RAD27. Neschopnost fosforylovat Whi5 tedy narušuje smyčku pozitivní zpětné vazby Cln1 / 2 a zase snižuje koherentní expresi regulonu.

Molekulární dynamika mezi dráhou páření a progresí buněčného cyklu

Pro další objasnění biochemického vysvětlení mezi zástavou páření a závazkem buněčného cyklu Doncic et al. provedl stejný test závaznosti popsaný výše na různých mutantních kmenech.[5] Mutant, FAR1-S87A, postrádá fosforylační místa CDK, a tak je inhibována Cln1 / 2 inhibice Far1. Výsledkem je zvýšení množství exportu Whi5 potřebného k spáchání buněčného dělení, což naznačuje, že fosforylace Far 1 je klíčem k buněčnému závazku. Naopak, mutant, STE5-8A, postrádající také místa pro fosforylaci CDK (a tím je ohrožena inhibice Cln1 / 2 Ste5), neposouvá bod závazku, což naznačuje, že taková inhibice spojovací dráhy není pro Start kritická. Další časosběrná analýza buněk STE5-8A odhalila, že tyto mutantní buňky se nemohou plně zavázat k buněčnému dělení, protože buňky vystavené alfa-faktoru se začnou budovat a poté se vrátí k páření bez dokončení buněčného cyklu. Doncic a kol. navrhl, že neúplné rozdělení bylo způsobeno expresí genů jak v pářící se dráze, tak v buněčné progresi řízené cyklinem G1. Sledování exprese FUS1pr-GFP, genu párovací dráhy a CLN2pr-mCherry, genu buněčného cyklu, skutečně prokázalo velkou koexpresi v buňkách STE5-8A ve srovnání s buňkami divokého typu.

Inhibice Cln1 / 2 Far1 tedy umožňuje vstup do buněčného cyklu (Start), zatímco inhibice Ste5 zaručuje zřetelnou expresi genů buď pro spojovací dráhu, nebo pro progresi buněčného cyklu.

Růst a kontrola buněčné výživy

Koncentrace vnějších živin jsou pro provedení kontrolního bodu Start nesmírně důležité. Dostupnost živin silně koreluje s velikostí buněčného růstu. Buňky nebudou pokračovat, pokud nedosáhnou určité velikosti kvůli nedostatku živin, obvykle dusíku. Větší buňky tedy stráví méně času v kontrolním bodě Start ve srovnání s menšími buňkami.[1]

Reference

  1. ^ A b C d E F Morgan, David. Buněčný cyklus: Principy buněčné kontroly. New Science Press Ltd., London, 2007; str. 196-203.
  2. ^ A b Hartwell, L. H. "Genetická kontrola cyklu buněčného dělení v kvasnicích, I. Detekce mutantů." Proceedings of the National Academy of Sciences 66.2 (1970): 352-59.
  3. ^ Zetterberg, A. a Olle Larsson. „Kinetická analýza regulačních událostí v G1 vedoucích k šíření nebo klidu švýcarských buněk 3T3.“ PNAS 82 (1985): 5365-369.
  4. ^ A b Skotheim, J .; DiTalia, S .; ED Siggia, E .; Cross, F. Pozitivní zpětná vazba cyklinů G1 zajišťuje koherentní vstup buněčného cyklu. Nature 454, 291-296 (2008).
  5. ^ A b C Doncic, Andreas, Melody Falleur-Fettig a Jan M. Skotheim. „Výrazné interakce Vyberte a udržujte specifický buněčný osud.“ Molecular Cell 43,4 (2011): 528-39.

Viz také