Extrakce DNA - DNA extraction

Pro různé metody viz Metody nukleových kyselin.

První izolace DNA byla provedena v roce 1869 Friedrich Miescher.[1] V současné době se jedná o rutinní postup v molekulární biologie nebo forenzní analýzy. Pro chemickou metodu se pro extrakci používá mnoho různých souprav a výběr správné sady ušetří čas na optimalizaci soupravy a postupy extrakce. PCR Detekce citlivosti je považována za ukazující rozdíly mezi komerčními soupravami.[2]

Dějiny

Základní postup

Mobilní a histon proteiny vázané na DNA lze odstranit buď přidáním a proteáza nebo vysrážením proteinů pomocí sodík nebo octan amonný nebo extrahuje je fenol-chloroformem směs před srážením DNA.

Po izolaci je DNA rozpuštěna v mírně alkalickém pufru, obvykle v a TE pufr, nebo v ultra čistá voda.

Výběr metody

Mezi nejběžnější metody extrakce DNA patří organická extrakce, Chelexova extrakce, a extrakce na pevné fázi.[3] Tyto metody důsledně poskytují izolovanou DNA, ale liší se jak kvalitou, tak množstvím získané DNA. Při výběru metody extrakce DNA je třeba vzít v úvahu několik faktorů, včetně nákladů, času, bezpečnosti a rizika kontaminace.

Organická extrakce zahrnuje přidání a inkubaci v několika různých chemických roztocích;[3] včetně a lýza krok, extrakce fenol chloroformem, an srážení ethanolem a mycí kroky. Organická extrakce se v laboratořích často používá, protože je levná a poskytuje velké množství čisté DNA. I když je to snadné, zahrnuje mnoho kroků a trvá to déle než u jiných metod. Zahrnuje také nepříznivé používání toxických chemikálií fenol a chloroform a existuje zvýšené riziko kontaminace v důsledku přenosu DNA mezi více zkumavkami.[4] Před desítkami let bylo účinně vyvinuto několik protokolů založených na organické extrakci DNA,[5] ačkoli v posledních letech byly také vyvinuty a publikovány vylepšené a praktičtější verze těchto protokolů.[6]

Chelexova extrakce metoda zahrnuje přidání Chelexovy pryskyřice do vzorku, vaření roztoku, poté vortexování a odstředění. Buněčné materiály se vážou na kuličky Chelex, zatímco DNA je k dispozici v supernatant.[4] Metoda Chelex je mnohem rychlejší a jednodušší než organická extrakce a vyžaduje pouze jednu zkumavku, což snižuje riziko kontaminace DNA. Chelexova extrakce bohužel nepřináší tolik množství a získaná DNA je jednovláknová, což znamená, že ji lze použít pouze pro PCR -založené analýzy a ne pro RFLP.[4]

Extrakce na pevné fázi například pomocí a extrakce založená na rotační koloně metoda využívá skutečnosti, na kterou se DNA váže oxid křemičitý. Vzorek obsahující DNA se přidá do kolony obsahující silikagel nebo kuličky oxidu křemičitého a chaotropní soli. Chaotropní soli narušují vodíkovou vazbu mezi řetězci a usnadňují vazbu DNA na oxid křemičitý tím, že způsobují hydrofobnost nukleových kyselin. Tím jsou vystaveny fosfátové zbytky, takže jsou k dispozici pro adsorpci.[7] DNA se váže na oxid křemičitý, zatímco zbytek roztoku se promyje ethanolem, aby se odstranily chaotropní soli a další zbytečné složky.[3] DNA pak může být rehydratována vodnými roztoky s nízkým obsahem soli, což umožňuje eluce DNA z kuliček.

Tato metoda poskytuje vysoce kvalitní, převážně dvouvláknovou DNA, kterou lze použít pro oba PCR a RFLP analýza. Tento postup lze automatizovat[4] a má vysokou propustnost, i když nižší než metoda fenol-chloroform. Jedná se o jednokrokovou metodu, tj. Celý postup je dokončen v jedné zkumavce. To snižuje riziko kontaminace, což je velmi užitečné pro forenzní extrakci DNA. Několik komerčních souprav pro extrakci na pevnou fázi vyrábí a prodává různé společnosti; jediný problém je, že jsou dražší než organická extrakce nebo Chelexova extrakce.

Speciální typy

Pro izolaci DNA z některých vzorků musí být zvoleny specifické techniky. Typické vzorky s komplikovanou izolací DNA jsou:

  • archeologické vzorky obsahující částečně degradovanou DNA, viz starodávná DNA [8]
  • vzorky obsahující inhibitory následných analytických postupů, zejména inhibitory PCR, jako huminová kyselina z půdy, indigo a jiná textilní barviva nebo hemoglobin v krvi
  • například vzorky z mikroorganismů se silnou buněčnou stěnou droždí
  • vzorky obsahující smíšenou DNA z více zdrojů

Extrachromozomální DNA je obecně snadno izolovatelná, zejména plazmidy mohou být snadno izolovány buněčnou lýzou následovanou srážením proteinů, které zachycují chromozomální DNA v nerozpustné frakci a po centrifugaci může být plazmidová DNA purifikována z rozpustné frakce.

Extrakce Hirt DNA je izolací všeho extrachromozomální DNA v savčí buňce. Proces extrakce Hirt se zbaví vysoké molekulové hmotnosti nukleární DNA a ponechává pouze nízkou molekulovou hmotnost mitochondriální DNA a jakékoli virové epizomy přítomný v buňce.

Detekce DNA

Hlavní článek: Kvantifikace nukleových kyselin

A indikátor difenylaminu (DPA) potvrdí přítomnost DNA. Tento postup zahrnuje chemickou hydrolýzu DNA: při zahřátí (např. ≥ 95 ° C) v kyselině vyžaduje reakce a deoxyribózový cukr a proto je specifický pro DNA. Za těchto podmínek se 2-deoxyribóza převede na w-hydroxylevulinyl aldehyd, který reaguje se sloučeninou, difenylaminem, za vzniku modře zbarvené sloučeniny. Koncentraci DNA lze určit měřením intenzity absorbance roztoku při 600 nm pomocí a spektrofotometr a ve srovnání s a standardní křivka známých koncentrací DNA.

Měření intenzity absorbance roztoku DNA při vlnových délkách 260 nm a 280 nm se používá jako měřítko čistoty DNA. DNA absorbuje UV světlo při 260 a 280 nanometrech a aromatické proteiny absorbují UV světlo při 280 nm; čistý vzorek DNA má poměr 1,8 při 260/280 a je relativně bez proteinové kontaminace. Přípravek DNA, který je kontaminován proteinem, bude mít poměr 260/280 nižší než 1,8.

DNA může být kvantifikována řezáním DNA pomocí a restrikční enzym, běží na agarose gel, barvení s ethidiumbromid (EtBr) nebo jiné barvení a porovnání intenzity DNA s DNA markerem známé koncentrace.

Za použití Southern blot technikou lze tuto kvantifikovanou DNA izolovat a dále zkoumat pomocí PCR a RFLP analýza. Tyto postupy umožňují diferenciaci opakovaných sekvencí v genomu. Právě tyto techniky forenzní vědci používají pro srovnání, identifikaci a analýzu.

Viz také

Reference

  1. ^ Dahm R (leden 2008). „Objevování DNA: Friedrich Miescher a první roky výzkumu nukleových kyselin“. Genetika člověka. 122 (6): 565–81. doi:10.1007 / s00439-007-0433-0. PMID  17901982.
  2. ^ Yoshikawa H, Dogruman-Al F, Dogruman-Ai F, Turk S, Kustimur S, Balaban N, Sultan N (říjen 2011). "Hodnocení souprav pro extrakci DNA pro molekulární diagnostiku lidských podtypů Blastocystis z fekálních vzorků". Parazitologický výzkum. 109 (4): 1045–50. doi:10.1007 / s00436-011-2342-3. PMID  21499752.
  3. ^ A b C Elkins KM (2013). "Extrakce DNA". Forenzní biologie DNA. 39–52. doi:10.1016 / B978-0-12-394585-3.00004-3. ISBN  9780123945853.
  4. ^ A b C d Butler JM (2005). Forenzní DNA typizace: biologie, technologie a genetika markerů STR (2. vyd.). Amsterdam: Elsevier Academic Press. ISBN  9780080470610. OCLC  123448124.
  5. ^ Marmur, J. (1961). „Postup izolace deoxyribonukleové kyseliny z mikroorganismů“. Journal of Molecular Biology. 3 (2): 208 – IN1. doi:10.1016 / S0022-2836 (61) 80047-8.
  6. ^ Salvà-Serra F, Svensson-Stadler L, Busquets A, Jaén-Luchoro D, Karlsson R, Moore ER, Gomila M (2018). „Protokol pro extrakci a čištění vysoce kvalitní a kvantitativní bakteriální DNA použitelný pro sekvenování genomu: Upravená verze postupu Marmur“. Výměna protokolů. doi:10.1038 / protex.2018.084.
  7. ^ Li, Richard (11. března 2015). Forenzní biologie (2. vyd.). Boca Raton. ISBN  978-1439889725. OCLC  907517669.
  8. ^ Pääbo S (březen 1989). „Starověká DNA: extrakce, charakterizace, molekulární klonování a enzymatická amplifikace“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 86 (6): 1939–43. Bibcode:1989PNAS ... 86.1939P. doi:10.1073 / pnas.86.6.1939. PMC  286820. PMID  2928314.

Další čtení

  • Sambrook, Michael R. Green, Joseph. Molekulární klonování. (4. vydání, ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Pr. ISBN  1936113422.
  • Forensic Biology, Richard Li, (2015) Boca Raton: CRC Press, Taylor & Francis Group. ISBN  9781439889701

externí odkazy