Purifikace nukleových kyselin na bázi kolony - Spin column-based nucleic acid purification

Oxid křemičitý ve rotační koloně s vodou a vzorkem DNA v chaotropní nárazník

Purifikace nukleových kyselin na bázi kolony je extrakce na pevné fázi metoda rychlého čištění nukleové kyseliny. Tato metoda se spoléhá na skutečnost, že nukleová kyselina bude svázat do pevné fáze oxid křemičitý za určitých podmínek.

Postup

Fáze metody jsou lýza, vázání, promývání a eluce, [1][2] tj. lýza buněk, navázání nukleové kyseliny na membránu silikagelu, promytí nukleové kyseliny navázané na membránu silikagelu a eluce nukleové kyseliny.

Chcete-li lyžovat, buňky a vzorek jsou zpracovány pomocí a lytický postup, který zahrnuje porušení buněčná membrána a uvolnění nukleové kyseliny.

Pro vázání, a pufrovací roztok se poté přidá do vzorku spolu s ethanol nebo isopropanol. Toto tvoří vazebné řešení. Vazebný roztok se přenese do a rotační kolona a sloupec je vložen do odstředivka. Odstředivka tlačí vazebný roztok přes membránu silikagelu, která je uvnitř rotační kolony. Pokud pH a sůl Koncentrace vazebného roztoku jsou optimální, nukleová kyselina se při průchodu roztoku váže na membránu silikagelu.

Pro promytí se průtok odstraní a do kolony se přidá promývací pufr. Kolona se znovu umístí do centrifugy, čímž se promývací pufr protlačí přes membránu. Tím se z membrány odstraní všechny zbývající nečistoty a na silikagelu zůstane pouze nukleová kyselina.

Pro eluci se promývací pufr odstraní a přidá se eluce do kolony se přidá pufr (nebo jednoduše voda). Kolona se znovu umístí do centrifugy, přičemž se eluční pufr protlačuje membránou. Eluční pufr odstraňuje nukleovou kyselinu z membrány a nukleová kyselina se shromažďuje ze spodní části kolony.

Související metody

Ještě před metody nukleových kyselin zaměstnán dnes bylo známo, že v přítomnosti chaotropní látky, jako jodid sodný nebo chloristan sodný DNA se váže na oxid křemičitý, skleněné částice nebo do jednobuněčný řasy volala rozsivky které chrání jejich buněčné stěny oxid křemičitý. Tato vlastnost byla použita k čištění nukleové kyseliny pomocí skleněného prášku nebo kuliček oxidu křemičitého za alkalických podmínek.[3] Toto bylo později vylepšeno pomocí guanidinium thiokyanát nebo guanidinium hydrochlorid jako chaotropní látka.[4] Použití skleněných kuliček bylo později změněno na silikagel.

Viz také

Reference

  1. ^ Matson, Robert S. (2008). Microarray metody a protokoly. Boca Raton, Florida: CRC. str. 27–29. ISBN  978-1420046656.
  2. ^ Kumar, Anil (2006). Genetické inženýrství. New York: Nova Science Publishers. 101–102. ISBN  159454753X.
  3. ^ Marko MA, Chipperfield R, Birnboim HC. Postup pro izolaci vysoce purifikované plazmidové DNA ve velkém měřítku pomocí alkalické extrakce a vazby na skleněný prášek. Anal Biochem. 1982 duben; 121 (2): 382-7.PMID  6179438
  4. ^ Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rychlá a jednoduchá metoda čištění nukleových kyselin. J Clin Microbiol. 1990 Mar; 28 (3): 495-503. PMID  1691208