Proteinové metody - Protein methods
 | Tento článek má několik problémů. Prosím pomozte vylepši to nebo diskutovat o těchto otázkách na internetu diskusní stránka. (Zjistěte, jak a kdy tyto zprávy ze šablony odebrat) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) |
Proteinové metody jsou techniky používané ke studiu bílkoviny. Existují experimentální způsoby studia proteinů (např. pro detekci proteinů, pro izolaci a čištění proteinů a pro charakterizaci struktury a funkce proteinů, často vyžadujících, aby byl protein nejprve purifikován). Výpočetní metody obvykle používají počítačové programy k analýze proteinů. Mnoho experimentálních metod (např. hmotnostní spektrometrie ) vyžadují výpočetní analýzu nezpracovaných dat.
Genetické metody
Experimentální analýza proteinů obvykle vyžaduje expresi a čištění proteinů. Exprese se dosahuje manipulací s DNA, která kóduje požadovaný protein (proteiny). Analýza proteinů proto obvykle vyžaduje zejména metody DNA klonování. Některé příklady genetických metod zahrnují koncepční překlad, Místně zaměřená mutageneze, používat fúzní protein a přiřazení alely k chorobným stavům. Některé proteiny nebyly nikdy přímo sekvenovány, avšak překladem kodony ze známých sekvencí mRNA do aminokyseliny metodou známou jako koncepční překlad. (Vidět genetický kód.) Místně zaměřená mutageneze selektivně zavádí mutace, které mění strukturu proteinu. Funkci částí proteinů lze lépe pochopit studiem změny v fenotyp v důsledku této změny. Fúzní proteiny se vyrábějí vložením proteinových značek, jako je Jeho značka, k produkci modifikovaného proteinu, který je snadnější sledovat. Příkladem toho může být GFP-Snf2H, který se skládá z proteinu vázaného na a zelený fluorescenční protein za vzniku hybridního proteinu. Analýzou DNA alely lze identifikovat jako spojené s chorobnými stavy, jako například v výpočet skóre LOD.
Extrakce bílkovin z tkání
Extrakce bílkovin z tkání tvrdými extracelulárními matricemi (např. Vzorky biopsie, žilní tkáně, chrupavky, kůže) se často dosahuje v laboratorním prostředí nárazovou práškovou metodou v kapalném dusíku. Vzorky jsou zmrazeny v kapalném dusíku a následně podrobeny nárazům nebo mechanickému mletí. Protože voda ve vzorcích se při této teplotě stává velmi křehkou, vzorky se často redukují na soubor jemných fragmentů, které lze poté rozpustit pro extrakci bílkovin. K tomuto účelu se někdy používají zařízení z nerezové oceli známé jako tkáňové drtiče.
Mezi výhody těchto zařízení patří vysoká úroveň extrakce bílkovin z malých cenných vzorků, mezi nevýhody patří nízkoúrovňová křížová kontaminace.
Čištění bílkovin
- Izolace proteinů
- Chromatografické metody: iontová výměna, vylučovací chromatografie (nebo gelová filtrace), afinitní chromatografie
- Extrakce a solubilizace bílkovin
- Koncentrace proteinových roztoků
- Gelová elektroforéza
- Gelová elektroforéza za denaturačních podmínek
- Gelová elektroforéza za nedenaturačních podmínek
- 2D gelová elektroforéza
- Elektrofokusování
Detekce proteinů
Díky značně malé velikosti proteinových makromolekul je identifikace a kvantifikace neznámých proteinových vzorků obzvláště obtížná. Pro zjednodušení procesu bylo vyvinuto několik spolehlivých metod pro kvantifikaci proteinu. Mezi tyto metody patří Warburg-Christian, Lowry Assay a Bradford Assay (všechny se spoléhají na absorpční vlastnosti makromolekul).
Bradfordova metoda používá k navázání na protein barvivo. Nejčastěji se používá barvivo Coomassie Brilliant Blue G-250. Pokud neobsahuje bílkoviny, je barvivo červené, ale jakmile se naváže na bílkoviny, zmodrá. Komplex barvivo-protein absorbuje světlo maximálně na vlnové délce 595 nanometrů a je citlivý na vzorky obsahující kdekoli od 1 ug do 60 ug. Na rozdíl od Lowryho a Warburg-Christianových metod se Bradfordovy testy nespoléhají na obsah tryptofanu a tyrosinu v proteinech, což umožňuje hypotetickou přesnost metody.
Lowryho test je podobný biuretovým testům, ale pro kvantifikaci používá Folinovo činidlo, které je přesnější. Folinové činidlo je stabilní pouze za kyselých podmínek a metoda je náchylná ke zkreslení výsledků v závislosti na množství tryptofanu a tyrosinu ve zkoumaném proteinu. Folinovo činidlo se váže na tryptofan a tyrosin, což znamená, že koncentrace těchto dvou aminokyselin ovlivňuje citlivost metody. Metoda je citlivá na rozsahy koncentrací podobné Bradfordově metodě, vyžaduje však nepatrné množství více bílkovin.
Warburg-Christian metoda vyšetřuje proteiny v jejich přirozeně se vyskytujících absorbančních rozmezích. Většina proteinů absorbuje světlo velmi dobře při 280 nanometrech kvůli přítomnosti tryptofanu a tyrosinu, ale metoda je citlivá na různá množství aminokyselin, na které spoléhá.
Níže je uvedeno více metod, které odkazují na podrobnější účty pro jejich příslušné metody.
Nespecifické metody, které detekují pouze celkový protein
- Absorbance: Číst při 280 nebo 215 nm. Může být velmi nepřesné. Detekce v rozmezí od 100 μg / ml do 1 mg / ml. Poměr hodnot absorbance naměřených při 260/280 může indikovat čistotu / znečištění vzorku (čisté vzorky mají poměr <0,8)
- Bradfordův proteinový test: Detekce v rozsahu ~ 1 mg / ml
- Testy odvozené z biuretového testu:
- Test na kyselinu bicinchoninovou (test BCA): Detekce až na 0,5 μg / ml
- Lowry Protein Assay: Detekce v rozmezí 0,01–1,0 mg / ml
- Fluoreskamin: Kvantifikuje proteiny a peptidy v roztoku, pokud jsou v aminokyselinách přítomny primární aminy
- Amido černá: Detekce v rozmezí 1-12 μg / ml
- Koloidní zlato: Detekce v rozsahu 20 - 640 ng / ml
- Dusík detekce:
- Kjeldahlova metoda: používá se hlavně k jídlu a vyžaduje oxidaci materiálu
- Dumasova metoda: používá se hlavně k jídlu a vyžaduje spalování materiálu
Specifické metody, které dokážou detekovat množství jediného proteinu
- Spektrometrické metody:
- Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): Chromatografická metoda pro detekci proteinů nebo peptidů
- Kapalinová chromatografie – hmotnostní spektrometrie (LC / MS): Může detekovat proteiny v nízkých koncentracích (ng / ml až pg / ml) v krvi a tělesných tekutinách, například pro Farmakokinetika.
- Protilátka závislé metody:
- Enzymaticky vázaný imunosorbent (ELISA ): Konkrétně dokáže detekovat bílkoviny až na pg / ml.
- Imunoprecipitace proteinů: technika srážení proteinového antigenu z roztoku pomocí protilátky, která se specificky váže na daný konkrétní protein.
- Imunoelektroforéza: separace a charakterizace proteinů na základě elektroforézy a reakce s protilátkami.
- Western blot: spojuje gelovou elektroforézu a inkubaci s protilátkami k detekci specifických proteinů ve vzorku tkáňového homogenátu nebo extraktu (typ Imunoelektroforéza technika).
- Imunologické barvení proteinů
Proteinové struktury
- Rentgenová krystalografie
- Proteinová NMR
- Kryoelektronová mikroskopie
- Malý úhel rentgenového rozptylu
- Kruhový dichroismus
Interakce zahrnující proteiny
Interakce protein-protein
- (Kvasinky) dvouhybridní systém
- Test komplementace proteinových fragmentů
- Koimunoprecipitace
- Afinitní čištění a hmotnostní spektrometrie
- Test ligace proximity
- Blízké označení
Interakce protein-DNA
Interakce protein-RNA
Výpočtové metody
- Molekulární dynamika
- Predikce struktury proteinů
- Zarovnání sekvence proteinů (porovnání sekvencí, včetně VÝBUCH )
- Strukturální vyrovnání proteinů
- Proteinová ontologie (viz genová ontologie )
Jiné metody
- Výměna vodík-deuterium
- Hmotnostní spektrometrie
- Sekvenování proteinů
- Proteosyntéza
- Proteomika
- Peptidové hromadné otisky prstů
- Stanovení vazby ligandu
- Východní blot
- Metabolické značení
- Značení těžkými izotopy
- Radioaktivní izotopové značení
Viz také
Bibliografie
- Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki a Stuart J. Edelstein. (1996) Proteinové metody, 2. vyd., Wiley Publishers. ISBN 0-471-11837-0.