PstI - PstI

PstJá je typu II restrikční endonukleáza izolované z gramnegativních druhů, Providencia stuartii.

Funkce

PstŠtípám DNA na rozpoznávací sekvenci 5'-CTGCA / G-3 'generující fragmenty s 3'-soudržnými konci.[1] Toto štěpení vede lepivé konce 4 páry bází dlouhé. PstI je katalyticky aktivní jako dimer. Obě podjednotky jsou spojeny 2-násobnou osou symetrie, která se v komplexu se substrátem shoduje s osou dyadu sekvence rozpoznávání. Má molekulovou hmotnost 69 500 a obsahuje 54 pozitivních a 41 negativně nabitých zbytků.[2]

Sekvence rozpoznáváníŘezané stránky
 5'CTGCAG 3 '3'GACGTC 5'
 5 '- CTGCA G - 3' 3 '- G ACGTC - 5'

PstI systém omezení / modifikace (R / M) má dvě složky: restrikční enzym, který štěpí cizí DNA, a methyltransferáza které chrání nativní řetězce DNA prostřednictvím methylace histonu. Kombinace obou poskytuje obranný mechanismus proti napadení viry.[3] Methyltransferáza a endonukleáza jsou kódovány jako dva samostatné proteiny a působí nezávisle. V systému PstI jsou geny kódovány na opačných řetězcích, a proto musí být přepsal odlišně od samostatného promotéři. Místa iniciace transkripce jsou oddělena pouze 70 základní páry.[4] Zpoždění exprese endonukleázy ve srovnání s methylázou je způsobeno inherentními rozdíly těchto dvou proteinů.[5] Endonukleáza je dimer, který vyžaduje druhý krok pro sestavení, zatímco methyláza je monomer.

PstI je funkčně ekvivalentní s BsuBI. Oba enzymy rozpoznávají cílovou sekvenci 5'CTGCAG. Enzymové systémy mají podobné methyltransferázy (41% aminokyselinová identita), restrikční endonukleázy (46% aminokyselinová identita) a genetické složení (58% nukleotidová identita).[6] Tato pozorování naznačují sdílené evoluční Dějiny.

Při zkoumání preferenčního dvouřetězcového štěpení DNA se restrikční endonukleáza PstI váže na plazmidovou DNA pSM1.[7]

Klonování DNA

PstI je užitečný enzym pro klonování DNA, protože poskytuje selektivní systém pro generování hybridních molekul DNA.[8] Tyto hybridní molekuly DNA mohou být poté štěpeny na regenerovaných místech PstI. Jeho použití není omezeno na molekulární klonování; používá se také při mapování restrikčních míst, genotypizaci, Southern blotování, polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) a SNP.[9] Je to také isoschizomer restrikční enzym SalPI z Streptomyces albus P.[10]

Výstřih

PstI přednostně štěpí purifikovanou DNA pSM1, aniž by byla ovlivněna superhelicitou substrátu.[11] Není však známo, zda k účinkům tohoto štěpení dochází po navázání na rozpoznávací místo nebo štěpení DNA. Jeho rozdílné rychlosti štěpení na různých restrikčních místech jsou způsobeny pěti rysy duplexní struktury. Blízkost ke koncům v lineární molekule DNA, variace sekvence DNA v rozpoznávacích místech pro enzymy, krátká vzdálenost mezi oblastmi neobvyklých sekvencí DNA a rozpoznávacích míst a nakonec speciální struktury, jako jsou smyčky a vlásenky. Společný účinek těchto pěti faktorů by mohl ovlivnit přístupnost restrikčního enzymu k jeho rozpoznávacím místům.

Vztah

Reference

  1. ^ „PstI (10 U / L) - Thermo Fisher Scientific“. www.thermofisher.com. Citováno 2016-04-29.
  2. ^ Walder, R. Y .; Walder, J. A .; Donelson, J. E. (1984-06-25). "Organizace a kompletní nukleotidová sekvence systému PstI restrikčně-modifikačních". The Journal of Biological Chemistry. 259 (12): 8015–8026. ISSN  0021-9258. PMID  6330092.
  3. ^ Walder, R. Y .; Hartley, J.L .; Donelson, J. E.; Walder, J. A. (01.03.1981). „Klonování a exprese restrikčně-modifikačního systému Pst I v Escherichia coli“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 78 (3): 1503–1507. Bibcode:1981PNAS ... 78,1503W. doi:10.1073 / pnas.78.3.1503. ISSN  0027-8424. PMC  319159. PMID  6262807.
  4. ^ Walder, R. Y .; Walder, J. A .; Donelson, J. E. (1984-06-25). "Organizace a úplná nukleotidová sekvence systému PstI restrikčně-modifikačních". The Journal of Biological Chemistry. 259 (12): 8015–8026. ISSN  0021-9258. PMID  6330092.
  5. ^ Walder, R. Y .; Walder, J. A .; Donelson, J. E. (1984-06-25). "Organizace a úplná nukleotidová sekvence systému PstI restrikčně-modifikačních". The Journal of Biological Chemistry. 259 (12): 8015–8026. ISSN  0021-9258. PMID  6330092.
  6. ^ Xu, GL; Kapfer, W; Walter, J; Trautner, TA (1992-12-25). „BsuBI - isospecifický restrikční a modifikační systém PstI: charakterizace genů a enzymů BsuBI“. Výzkum nukleových kyselin. 20 (24): 6517–6523. doi:10.1093 / nar / 20.24.6517. ISSN  0305-1048. PMC  334566. PMID  1480472.
  7. ^ Armstrong, Karen (1982). "Preferenční štěpení závislé na místě restrikční endonukleázou PstI". Výzkum nukleových kyselin. 10 (3): 993–1007. doi:10.1093 / nar / 10.3.993. PMC  326216. PMID  6278444.
  8. ^ Bolivar, F; Rodriguez, RL; Greene, PJ; Betlach, MC; Heyneker, HL; Boyer, HW; Crosa, JH; Falkow, S (1977). „Konstrukce a charakterizace nových klonovacích vozidel. II. Víceúčelový klonovací systém“. Gen. 2 (2): 95–113. doi:10.1016/0378-1119(77)90000-2. PMID  344137.
  9. ^ "PstI".
  10. ^ Carter, Jacqueline (1980). „Srovnání štěpení DNA restrikčními enzymy SalPI a PstI“. Výzkum nukleových kyselin. 8 (21): 4943–54. doi:10.1093 / nar / 8.21.4943. PMC  324271. PMID  6255438.
  11. ^ Thomas, M (1975). "Studie o štěpení bakteriofágové DNA lambda endonukleázou EcoRI Restriction". Journal of Molecular Biology. 91 (3): 315–328. doi:10.1016/0022-2836(75)90383-6. PMID  1102702.