EcoRV - EcoRV
| Restrikční endonukleáza EcoRV | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Krystalová struktura EcoRV komplexovaná s dvouvláknovou DNA | |||||||||
| Identifikátory | |||||||||
| Symbol | Endonuc-EcoRV | ||||||||
| Pfam | PF09233 | ||||||||
| InterPro | IPR015314 | ||||||||
| SCOP2 | 1sx5 / Rozsah / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
EcoRV (vyslovuje se „eco R five“) je omezení typu II endonukleáza izolované z určitých kmenů Escherichia coli. Má alternativní název Eco32I.
v molekulární biologie, je to běžně používané restrikční enzym. Vytváří to tupé konce. Enzym rozpoznává palindromickou 6-bazickou DNA sekvenci 5'-GAT | ATC-3 'a provede řez ve svislé linii. Komplementární sekvence je pak 3'-CTA | TAG-5 '. Konce jsou tupé a lze je snadno ligovat do tupého klonovacího místa, ale s nižší účinností než lepivé konce.
Struktura
Struktura tohoto enzymu a několika mutantů v komplexu se sekvencí DNA, kterou štěpí, byla vyřešena Rentgenová krystalografie.
Jádro enzymu tvoří pětvláknový smíšený β-list ohraničený a-šroubovicemi. Jádro je konzervováno ve všech ostatních restrikčních endonukleázách typu II. Má také subdoménu N-terminální dimerizace tvořenou krátkou α-spirálou, dvouvláknovou antiparalelní fólií a dlouhou α-spirálou. Tato subdoména se nachází pouze v EcoRV a PvuII.[1]
Režim akce
Jako EcoRI, EcoRV tvoří a homodimer v roztoku před vazbou a jednáním podle ní sekvence rozpoznávání.[2] Enzym se zpočátku váže slabě na nespecifické místo na DNA. Náhodně kráčí podél molekuly, dokud není nalezeno specifické rozpoznávací místo.[1] EcoRV má vysokou specificitu pro svou cílovou sekvenci DNA.
Vazba enzymu indukuje konformační změnu v DNA tím, že ji ohne asi o 50 °. Ohýbání DNA má za následek uvolnění bází, rozšíření vedlejší drážky a stlačení hlavní drážky. Tím se fosfodiesterová vazba přeruší blíže k aktivnímu místu enzymu, kde se může štěpit. K štěpení dochází v rámci rozpoznávací sekvence a dochází k ní ne vyžadují hydrolýzu ATP.[1]
EcoRV je jediné omezení typu II endonukleáza je známo, že způsobuje velkou konformační změnu DNA vyvolanou proteinem.[1]
Použití
EcoRV se často používá k rozříznutí a plazmid vektor pro vložení a gen -zájem během genové klonování. Enzym dodává mnoho výrobců a vyžaduje hovězí sérový albumin správně fungovat.
Viz také
- EcoRI, další nukleázový enzym z E-coli.
- EcoRII, další nukleázový enzym z E-coli.
- FokI, nukleázový enzym z Flavobacterium okeanokoites[3]
Reference
- ^ A b C d Pingoud A, Jeltsch A (2001). "Struktura a funkce restrikčních endonukleáz typu II". Výzkum nukleových kyselin. 29 (18): 3705–3727. doi:10.1093 / nar / 29.18.3705. PMC 55916. PMID 11557805.
- ^ Bitinaite J, Wah DA, Aggarwal AK, Schildkraut I (1998). „K štěpení DNA je nutná dimerizace FokI. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (18): 10570–10575. Bibcode:1998PNAS ... 9510570B. doi:10.1073 / pnas.95.18.10570. PMC 27935. PMID 9724744.
- ^ Zahran, M., Daidone, I., Smith, J. C., & Imhof, P. (2010). Mechanismus rozpoznávání DNA restrikčním enzymem EcoRV. Journal of Molecular Biology, 401 (3), 415-432.
