Genový knockout - Gene knockout
A genový knockout (zkratka: KO) je genetický technika, při které jeden z organismus je geny je nefunkční („vyřazen“ z organismu). KO však může také odkazovat na gen, který je vyřazen, nebo na organismus, který nese genový knockout. Vyřazovací organismy nebo jednoduše vykrojení se používají ke studiu funkce genů, obvykle vyšetřováním vlivu ztráty genů. Vědci vyvozují závěry z rozdílu mezi vyřazeným organismem a normálními jedinci.
Technika KO je v podstatě opakem a gen knock-in. Vyřazení dvou genů současně v organismu je známé jako dvojitý knockout (DKO). Podobně podmínky trojitý knockout (TKO) a čtyřnásobné knockouty (QKO) se používají k popisu tří nebo čtyř vyřazených genů. Je však třeba rozlišovat mezi heterozygotní a homozygotní KO. V prvním případě pouze jedna ze dvou genových kopií (alely ) je vyřazen, v druhém případě jsou vyřazeni oba.
Metody
Vyřazení se provádí pomocí různých technik. Původně, přirozeně se vyskytující mutace byly identifikovány a poté musela být stanovena ztráta nebo inaktivace genů Sekvenování DNA nebo jiné metody.[1]

Homologní rekombinace
Tradičně, homologní rekombinace byl hlavní způsob vyvolání genového knockoutu. Tato metoda zahrnuje vytvoření a DNA konstrukt obsahující požadovanou mutaci. Pro účely vyřazení to obvykle zahrnuje marker rezistence na léčivo místo požadovaného genu pro vyřazení.[2] Konstrukt bude také obsahovat minimálně 2 kB homologie do cílové sekvence.[2] Konstrukt lze dodat kmenové buňky buď skrz mikroinjekce nebo elektroporace.[2] Tato metoda se pak spoléhá na vlastní opravné mechanismy buňky, aby rekombinovala konstrukt DNA do existující DNA. To má za následek změnu sekvence genu a ve většině případů gen bude přeloženo do nefunkčního protein, pokud je vůbec přeložen. Jedná se však o neefektivní proces, protože homologní rekombinace představuje pouze 10−2 do 10-3 integrace DNA.[2][3] Marker pro výběr léčiva v konstruktu se často používá k výběru buněk, ve kterých došlo k rekombinační události.
Lze použít tyto kmenové buňky, kterým nyní chybí gen in vivo například u myší jejich vložením do časných embryí.[2] Pokud by výsledná chimérická myš obsahovala genetickou změnu v jejich zárodečné linii, mohlo by to být předáno potomkům.[2]
v diploidní organismy, které obsahují dva alely pro většinu genů a může také obsahovat několik příbuzných genů, které spolupracují ve stejné roli, jsou prováděna další kola transformace a selekce, dokud není vyřazen každý cílový gen. Selektivní chov může být vyžadován k výrobě homozygotní vyřazovací zvířata.
Nukleázy specifické pro dané místo

V současné době se používají tři metody, které zahrnují přesné cílení sekvence DNA za účelem zavedení dvouvláknového zlomu. Jakmile k tomu dojde, pokusí se opravné mechanismy buňky opravit tento dvouvláknový zlom, často skrz nehomologní spojování konců (NHEJ), který zahrnuje přímé ligování dvou řezaných konců dohromady.[3] To může být provedeno nedokonale, proto někdy způsobí vložení nebo odstranění základních párů, které způsobí mutace posunu snímků. Tyto mutace mohou způsobit nefunkčnost genu, ve kterém se vyskytují, což vytváří vyřazení tohoto genu. Tento proces je účinnější než homologní rekombinace, a proto jej lze snadněji použít k vytvoření bialelických knockoutů.[3]
Zinkové prsty
Nukleázy se zinkovým prstem se skládají z DNA vazebných domén, které mohou přesně cílit sekvenci DNA.[3] Každý zinkový prst dokáže rozpoznat kodony požadované sekvence DNA, a proto může být modulárně sestaven tak, aby se navázal na konkrétní sekvenci.[5] Tyto vazebné domény jsou spojeny s a restrikční endonukleáza který může způsobit dvouvláknový zlom (DSB) v DNA.[3] Opravné procesy mohou zavádět mutace, které ničí funkčnost genu.
TALENS
Transkripční aktivátorové efektorové nukleázy (TALEN ) také obsahují doménu vázající DNA a nukleázu, která může štěpit DNA.[6] Oblast vázající DNA se skládá z opakování aminokyselin, z nichž každá rozpoznává jeden pár bází požadované cílené sekvence DNA.[5] Pokud je toto štěpení zaměřeno na gen kódující oblast a NHEJ zprostředkovaná oprava zavádí inzerce a delece, často dochází k mutaci posunu snímků, což narušuje funkci genu.[6]
CRISPR / Cas9
Seskupené pravidelně rozložené krátké palindromické repetice (CRISPR ) / Cas9 je metoda pro úpravu genomu, která obsahuje a průvodce RNA v komplexu s a Protein Cas9.[5] Vodicí RNA může být navržena tak, aby odpovídala požadované DNA sekvenci jednoduchým doplňkovým párováním bází, na rozdíl od časově náročného sestavování konstruktů vyžadovaných zinkovými prsty nebo TALENy.[7] Spojený Cas9 způsobí dvouřetězcový zlom DNA.[5] Na základě stejného principu jako zinkové prsty a TALENy vedou pokusy o opravu těchto dvouvláknových zlomů často k mutacím posunu snímků, které vedou k nefunkčnímu genu.[5]
Klepat
Gene zaklepal je podobný genovému knockoutu, ale místo vymazání nahradí gen jiným.
Typy
Podmíněné knockouty
Podmíněný knockout genu umožňuje deleci genu v tkáni časově specifickým způsobem. To je nutné místo genového knockoutu, pokud by nulová mutace vedla k embryonální smrt.[8] To se provádí zavedením krátkých sekvencí nazývaných loxP místa kolem genu. Tyto sekvence budou zavedeny do zárodečné linie stejným mechanismem jako knock-out. Tuto zárodečnou linii lze poté přejít na jinou zárodečnou linii obsahující Cre-rekombináza což je virový enzym, který dokáže rozpoznat tyto sekvence, rekombinuje je a odstraní gen ohraničený těmito místy.
Použití

Knockouty se používají především k pochopení role konkrétního gen nebo DNA regionu porovnáním knockoutu organismus do a divoký typ s podobným genetický Pozadí.
Knokaut organismy se také používají jako promítání nástroje při vývoji léky, cílit konkrétně biologické procesy nebo nedostatky pomocí konkrétního knockoutu nebo k pochopení mechanismus účinku a lék pomocí a knihovna knockout organismy přes celou genom, například v Saccharomyces cerevisiae.[9]
Viz také
- Esenciální gen
- Gene knockdown
- Podmíněný genový knockout
- Germline
- Umlčení genů
- Plánované vyhynutí
- Překombinování
- Myostatin
- Belgická modrá
Reference
- ^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin WC, Gelbart WM (2000). Úvod do genetické analýzy (7. vydání). New York: W. H. Freeman. ISBN 978-0-7167-3771-1.
- ^ A b C d E F Hall, Bradford; Limaye, Advait; Kulkarni, Ashok B. (01.09.2009). Přehled: Generace genových knockoutových myší. Současné protokoly v buněčné biologii. 44. Wiley-Blackwell. s. Jednotka 19.12 19.12.1–17. doi:10.1002 / 0471143030.cb1912s44. ISBN 978-0471143031. PMC 2782548. PMID 19731224.
- ^ A b C d E Santiago, Yolanda; Chan, Edmond; Liu, Pei-Qi; Orlando, Salvatore; Zhang, Lin; Urnov, Fyodor D .; Holmes, Michael C .; Guschin, Dmitry; Waite, Adam (2008-04-15). „Cílené vyřazení genů v buňkách savců pomocí vytvořených nukleáz se zinkovým prstem“. Sborník Národní akademie věd. 105 (15): 5809–5814. doi:10.1073 / pnas.0800940105. ISSN 0027-8424. PMC 2299223. PMID 18359850.
- ^ Egener T, Granado J, Guitton M, Hohe A, Holtorf H, Lucht JM a kol. (2002). „Vysoká frekvence fenotypových odchylek v rostlinách Physcomitrella patens transformovaných knihovnou narušení genů“. Biologie rostlin BMC. 2 (1): 6. doi:10.1186/1471-2229-2-6. PMC 117800. PMID 12123528.
- ^ A b C d E Gaj, Thomas; Gersbach, Charles A .; Barbas, Carlos F. (2013). „Metody genomového inženýrství založené na metodách ZFN, TALEN a CRISPR / Cas“. Trendy v biotechnologii. 31 (7): 397–405. doi:10.1016 / j.tibtech.2013.04.004. PMC 3694601. PMID 23664777.
- ^ A b Joung, J. Keith; Sander, Jeffry D. (leden 2013). „TALENs: široce použitelná technologie pro cílené úpravy genomu“. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1): 49–55. doi:10.1038 / nrm3486. ISSN 1471-0080. PMC 3547402. PMID 23169466.
- ^ Ni, Wei; Qiao, červen; Hu, Shengwei; Zhao, Xinxia; Regouski, Misha; Yang, Min; Polejaeva, Irina A .; Chen, Chuangfu (04.09.2014). „Efektivní vyřazení genů u koz pomocí systému CRISPR / Cas9“. PLOS ONE. 9 (9): e106718. doi:10.1371 / journal.pone.0106718. ISSN 1932-6203. PMC 4154755. PMID 25188313.
- ^ Le, Yunzheng; Sauer, Brian (01.03.2001). "Vyřazení podmíněného genu pomocí cre rekombinázy". Molekulární biotechnologie. 17 (3): 269–275. doi:10,1385 / MB: 17: 3: 269. ISSN 1073-6085. PMID 11434315.
- ^ „YeastDeletionWebPages“. Citováno 21. února 2017.