Překombinování - Recombineering

Překombinování (rekombinárodem zprostředkovaná genetická enginaléhání)[1] je genetická a molekulární biologie technika založená na homologní rekombinace systémy, na rozdíl od staršího / běžnějšího způsobu používání restrikční enzymy a ligázy kombinovat sekvence DNA ve stanoveném pořadí. Rekombinace je široce používána pro bakteriální genetiku při generování cílových vektorů pro vytváření podmíněnosti myší knockout, a pro modifikaci DNA jakéhokoli zdroje často obsaženého v a bakteriální umělý chromozom (BAC), mimo jiné aplikace.

Rozvoj

Ačkoli byly vyvinuty v bakteriích, většina inspirace pro techniky rekombinace pocházela z metod, které byly poprvé vyvinuty v Saccharomyces cerevisiae [2] kde byl použit lineární plazmid k cílení genů nebo klonování genů z chromozomu. Kromě toho rekombinace s jedním vláknem oligonukleotidy (oligos) byl poprvé uveden v Saccharomyces cerevisiae.[3] Bylo pozorováno, že k rekombinaci dochází s oligonukleotidy krátkými jako 20 bází.

Rekombinace je založena na homologní rekombinaci v Escherichia coli zprostředkovaný bakteriofág proteiny, buď RecE / RecT od Rac prophage [4] nebo Redαβδ z bakteriofág lambda.[5][6] Nejčastěji se nyní používá systém rekombinace lambda Red a první ukázky Redu in vivo genetické inženýrství nezávisle vytvořil Kenan Murphy[7] a Francis Stewart.[4][5] Murphyho experimenty však vyžadovaly expresi RecA a používaly také dlouhá ramena homologie. V důsledku toho nebyly zřejmé důsledky pro novou technologii inženýrství DNA. Laboratoř Stewart ukázala, že tyto homologní rekombinační systémy zprostředkovávají účinnou rekombinaci lineárních molekul DNA lemovaných sekvencemi homologie tak krátkými jako 30 párů bází (40-50 párů bází je účinnějších) do cíle DNA sekvence v nepřítomnosti RecA. Homologii by nyní mohli poskytnout oligonukleotidy vyrobené na zakázku a standardně recA mohli by být použity klonovací hostitelé, což značně rozšířilo užitečnost překombinování.

Rekombinace s dsDNA

Rekombinace využívá lineární substráty DNA, které jsou buď dvouvláknové (dsDNA), nebo jednovláknové (ssDNA). Nejčastěji se dsDNA rekombinace používá k vytvoření genových náhrad, delecí, inzercí a inverzí. Genové klonování[6][8] a značení genů / proteinů (His tagy atd., viz [9]) je také běžný. U genových náhrad nebo delecí se obvykle kazeta kódující gen rezistence na léčivo vyrábí pomocí PCR za použití bi-partitových primerů. Tyto primery se skládají z (od 5 '→ 3') 50 bází homologie do cílové oblasti, kam má být vložena kazeta, následovaných 20 bázemi k naplnění kazety rezistentní na léčivo. Přesná spojovací sekvence konečného konstruktu je určena designem primeru.[10][11] Tyto události se obvykle vyskytují na frekvenci přibližně 104/108buňky, které přežijí elektroporace. Elektroporace je metoda použitá k transformaci lineárního substrátu do rekombinační buňky.

Technika výběru / zpětného výběru

V některých případech si člověk přeje deleci bez zanechání markeru, aby došlo k fúzi genu nebo k mutaci bodu v genu. To lze provést dvěma koly rekombinace.[12] V první fázi rekombinace je zaveden selekční marker na kazetě, který nahradí oblast, která má být upravena. Ve druhém stupni je na kazetě vybrán druhý proteselekční marker (např. SacB) proti následujícímu zavedení cílového fragmentu obsahujícího požadovanou modifikaci. Alternativně může být cílový fragment ohraničen loxP nebo FRT weby, které lze později odstranit jednoduše vyjádřením Cre nebo FLP rekombinázy. Pro zvýšení účinnosti rekombinace byl také vyvinut nový selekční marker "mFabI".[13]

Rekombinace se ssDNA

Rekombinace se ssDNA poskytla průlom jak v efektivitě reakce, tak ve snadné tvorbě bodových mutací.[1] Tato technika byla dále vylepšena objevem, že zamezením systému opravy nesouladu s methylem lze frekvenci získávání rekombinantů zvýšit na více než 107/108 životaschopné buňky.[14] Tato frekvence je dostatečně vysoká, aby bylo možné provést změny bez výběru. S optimalizovanými protokoly obsahuje více než 50% buněk, které přežijí elektroporaci, požadovanou změnu. Rekombinace se ssDNA vyžaduje pouze protein Red Beta; Exo, gama a hostitelské rekombinační proteiny nejsou nutné. Jelikož proteiny homologní s Beta a RecT se nacházejí v mnoha bakteriích a bakteriofágech (od února 2010> 100), je rekombinace pravděpodobně účinná u mnoha různých bakterií.[15] Rekombinace se ssDNA tedy rozšiřuje genetické nástroje dostupné pro výzkum v různých organismech. K dnešnímu dni byla provedena rekombinace v E-coli, S. enterica, Y. pseudotuberkulóza, S. cerevisiae a M. tuberculosis.[16][17][18][19][20][21]

Nezávislá rekombinace

V roce 2010 bylo prokázáno, že k rekombinaci ssDNA může docházet při absenci známých rekombinačních funkcí.[22] Rekombinanty byly nalezeny až u 104/108 životaschopné buňky. Tato aktivita nezávislá na Red byla prokázána v P. syringae, E-coli, S. enterica serovar typhimurium a S. flexneria.

Aplikace a výhody rekombinace

Největší výhodou překombinování je, že odstraňuje potřebu vhodně umístěného restrikční weby zatímco v konvenčním genetickém inženýrství je modifikace DNA často ohrožena dostupností jedinečných restrikčních míst. Při konstrukci velkých konstrukcí o> 100 kb, jako je Bakteriální umělé chromozomy (BAC), neboli chromozomů, se rekombinace stala nutností. Rekombinace může generovat požadované úpravy, aniž by po sobě zanechala jakékoli „stopy“. Rovněž se vzdává několika klonování fáze pro generování meziproduktu vektory a proto se používá k modifikaci DNA konstruktů v relativně krátkém časovém rámci. Požadovaná homologie je dostatečně krátká na to, aby ji bylo možné vytvořit v syntetických oligonukleotidech, a samotná rekombinace s krátkými oligonukleotidy je neuvěřitelně účinná. Nedávno bylo vyvinuto rekombinování pro vysoce výkonné aplikace inženýrství DNA nazývané „rekombinační potrubí“.[23] Rekombinace potrubí podporuje produkci BAC ve velkém měřítku transgeny a genové cílení konstrukty pro funkční programy genomiky, jako je EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Consortium) a KOMP (Knock-Out Mouse Program). Rekombinace byla také automatizována, což je proces zvaný „MAGE“ - Multiplex Automated Genome Engineering, v církevní laboratoři.[24] S rozvojem technologií CRISPR, výstavba CRISPR interference kmeny v E-coli vyžaduje pouze jednokrokové překombinování oligo, poskytující jednoduchý a snadno implementovatelný nástroj pro kontrolu genové exprese.[12][25]U řady druhů rostlin byly zavedeny „nástroje pro překombinování“ a laboratorní protokoly. Tyto nástroje a postupy jsou přizpůsobitelné, škálovatelné a volně dostupné všem výzkumným pracovníkům. [26]

Reference

  1. ^ A b Ellis H. M., Yu D., DiTizio T., Court D. L. (2001). „Vysoce účinná mutageneze, opravy a inženýrství chromozomální DNA pomocí jednovláknových oligonukleotidů“. Sborník Národní akademie věd. 98 (12): 6742–6746. Bibcode:2001PNAS ... 98.6742E. doi:10.1073 / pnas.121164898. PMC  34423. PMID  11381128.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  2. ^ Orr-Weaver, T. L., J. W. Szostak a kol. (1983) Genetické aplikace transformace kvasinek s lineárními plazmidy a plazmidy s mezerami. Metody. Enzymol. 101: 228-245.
  3. ^ Moerschell R. P., Tsunasawa S .; et al. (1988). "Transformace kvasinek syntetickými oligonukleotidy". Sborník Národní akademie věd. 85 (2): 524–528. Bibcode:1988PNAS ... 85..524M. doi:10.1073 / pnas.85.2.524. PMC  279583. PMID  2829192.
  4. ^ A b Zhang Y., Buchholz F., Muyrers J. P., Stewart A. F. (1998). "Nová logika pro DNA inženýrství využívající rekombinaci v Escherichia coli". Genetika přírody. 20 (2): 123–128. doi:10.1038/2417. PMID  9771703.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  5. ^ A b Muyrers J. P., Zhang Y., Testa G., Stewart A. F. (1999). „Rychlá modifikace bakteriálních umělých chromozomů rekombinací ET“. Výzkum nukleových kyselin. 27 (6): 1555–1557. doi:10.1093 / nar / 27.6.1555. PMC  148353. PMID  10037821.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  6. ^ A b Yu D., Ellis H. M .; et al. (2000). „Efektivní rekombinační systém pro inženýrství chromozomů v Escherichia coli“. Sborník Národní akademie věd. 97 (11): 5978–5983. Bibcode:2000PNAS ... 97,5978Y. doi:10.1073 / pnas.100127597. PMC  18544. PMID  10811905.
  7. ^ Murphy K. C. (1998). „Použití rekombinačních funkcí bakteriofága λ k podpoře genové náhrady u Escherichia coli“. Journal of Bacteriology. 180 (8): 2063–2071. doi:10.1128 / JB.180.8.2063-2071.1998. PMC  107131. PMID  9555887.
  8. ^ Zhang, Y., Muyrers, J.P.P., Testa, G. a Stewart, A.F. (2000) Klonování DNA homologní rekombinací v Escherichia coli Nature Biotechnology 18, 1314-1317
  9. ^ Poser I, Sarov M, Hutchins JR, Hériché JK, Toyoda Y, Pozniakovsky A, Weigl D, Nitzsche A, Hegemann B, Bird AW, Pelletier L, Kittler R, Hua S, Naumann R, Augsburg M, Sykora MM, Hofemeister H „Zhang Y, Nasmyth K, White KP, Dietzel S, Mechtler K, Durbin R, Stewart AF, Peters JM, Buchholz F, Hyman AA (2008). „BAC TransgeneOmics: vysoce výkonná metoda pro zkoumání funkce bílkovin u savců“. Přírodní metody. 5 (5): 409–15. doi:10.1038 / nmeth.1199. PMC  2871289. PMID  18391959.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  10. ^ Sawitzke J. A., Thomason L. C., Costantino N., Bubunenko M., Datta S., Court D. L. (2007). "Rekombinace: in vivo genetické inženýrství v E. coli, S. enterica a dále". Advanced Bacterial Genetics: Use of Transposons and Phage for Genomic Engineering. Metody v enzymologii. 421. 171–199. doi:10.1016 / S0076-6879 (06) 21015-2. ISBN  9780123737496. PMID  17352923.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  11. ^ Thomason, L., D. L. Court, M. Bubunenko, N. Costantino, H. Wilson, S. Datta a A. Oppenheim, (2007) Rekombinace: Genetické inženýrství v bakteriích pomocí homologní rekombinace. V: Aktuální protokoly v Molekulární biologii. Hoboken, N.J .: John Wiley & Sons, Inc., s. Kapitola 1, jednotka 16 s. 11-24.
  12. ^ A b Li, X; Thomason, LC; Sawitzke, JA; Costantino, N; Court, DL (2013). „Pozitivní a negativní selekce pomocí kazety tetA-sacB: rekombinace a transdukce P1 v Escherichia coli“. Výzkum nukleových kyselin. 41 (22): e204. doi:10.1093 / nar / gkt1075. PMC  3905872. PMID  24203710.
  13. ^ Nový marker výběru pro efektivní klonování a překombinování DNA v E. coli
  14. ^ Costantino N., Court D. L. (2003). „Zvýšené hladiny λ červeně zprostředkovaných rekombinantů u mutantů opravujících nesoulad“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 100 (26): 15748–15753. Bibcode:2003PNAS..10015748C. doi:10.1073 / pnas.2434959100. PMC  307639. PMID  14673109.
  15. ^ Datta S., Costantino N., Zhou X., Court D. L. (2008). "Identifikace a analýza funkcí rekombinace z gramnegativních a grampozitivních bakterií a jejich fágů". Sborník Národní akademie věd. 105 (5): 1626–1631. Bibcode:2008PNAS..105.1626D. doi:10.1073 / pnas.0709089105. PMC  2234195. PMID  18230724.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  16. ^ Derbise, A., B. Lesic, D. Dacheux, J. M. Ghigo a E. Carniel, (2003) Rychlá a jednoduchá metoda pro inaktivaci chromozomálních genů v Yersinii. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 38: 113-116.
  17. ^ van Kessel J. C., Hatfull G. F. (2007). "Rekombinace v Mycobacterium tuberculosis". Přírodní metody. 4 (2): 147–152. doi:10.1038 / nmeth996. PMID  17179933.
  18. ^ van Kessel J. C., Hatfull G. F. (2008). "Rekombinace mykobakterií". Protokoly o mykobakteriích. Metody v molekulární biologii. 435. 203–215. doi:10.1007/978-1-4939-2450-9_10. ISBN  978-1-4939-2449-3. PMID  25779316.
  19. ^ van Kessel J. C., Hatfull G. F. (2008). „Efficient point mutagenesis in mycobacteria using single-stranded DNA recombineering: characterization of antimycobacterial drug goals“. Molekulární mikrobiologie. 67 (5): 1094–1107. doi:10.1111 / j.1365-2958.2008.06109.x. PMID  18221264.
  20. ^ van Kessel J. C., Marinelli L. J., Hatfull G. F. (2008). „Rekombinace mykobakterií a jejich fágů“. Příroda Recenze Mikrobiologie. 6 (11): 851–857. doi:10.1038 / nrmicro2014. PMC  3503148. PMID  18923412.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  21. ^ DiCarlo James E., Conley Andrew J., Penttilä Merja, Jäntti Jussi, Wang Harris H., Church George M. (2013). „Kvasinkové oligo zprostředkované genomové inženýrství (YOGE)“. ACS Syntetická biologie. 2 (12): 741–749. doi:10.1021 / sb400117c. PMC  4048964. PMID  24160921.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  22. ^ Swingle B., Markel E., Costantino N., Bubunenko M. G., Cartinhour S., Court D. L. (2010). "Rekombinace oligonukleotidů v gramnegativních bakteriích". Molekulární mikrobiologie. 75 (1): 138–148. doi:10.1111 / j.1365-2958.2009.06976.x. PMC  3404488. PMID  19943907.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  23. ^ Sarov M., Schneider S., Pozniakovski A., Roguev A., Ernst S., Zhang Y., Hyman A. A., Stewart A. F. (2006). „Rekombinovaný plynovod pro funkční genomiku aplikovaný na Caenorhabditis elegans“. Přírodní metody. 3 (10): 839–844. doi:10.1038 / nmeth933. PMID  16990816.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  24. ^ Wang H.H., Isaacs F. J., Carr P.A., Sun Z.Z., Xu G., Forest C.R., Church G.M. (2009). „Programování buněk multiplexním genomovým inženýrstvím a zrychlenou evolucí“. Příroda. 460 (7257): 894–898. Bibcode:2009 Natur.460..894W. doi:10.1038 / nature08187. PMC  4590770. PMID  19633652.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  25. ^ Li, X; Jun, Y; Erickstad, M; Brown, S; Parks, A; Court, D; Jun, S (2016). „tCRISPRi: laditelná a reverzibilní, jednokroková kontrola genové exprese“. Vědecké zprávy. 6: 39096. Bibcode:2016NatSR ... 639076L. doi:10.1038 / srep39076. PMC  5171832. PMID  27996021.
  26. ^ Brumos J, Zhao C, Gong Y, Soriano D, Patel AP, Perez-Amador MA, Stepanova AN, Alonso JM (2019). „Vylepšená sada nástrojů pro rekombinaci rostlin“. Rostlinná buňka. 32: tpc.00431.2019. doi:10.1105 / tpc.19.00431. PMC  6961616. PMID  31666295.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)

externí odkazy

  • redrecombineering.ncifcrf.gov - Podrobnosti o rekombinování, stejně jako protokoly, časté dotazy a lze je použít k vyžádání kmenů a plazmidů potřebných pro rekombinování.