Cre rekombináza - Cre recombinase
Cre rekombináza | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
Struktura enzymu Cre rekombinázy (dimeru) vázaného na jeho substrátovou DNA | |||||||
Identifikátory | |||||||
Organismus | |||||||
Symbol | cre | ||||||
Entrez | 2777477 | ||||||
RefSeq (Prot) | YP_006472.1 | ||||||
UniProt | P06956 | ||||||
Další údaje | |||||||
EC číslo | 2.7.7.- | ||||||
Chromozóm | genom: 0 - 0 Mb | ||||||
|
Cre rekombináza je tyrosin rekombináza enzym odvozeno z Bakteriofág P1. Enzym používá a topoizomeráza I -jaký mechanismus provést site specific rekombinace Události. Enzym (38 kDa) je členem integráza rodina místně specifické rekombinázy a je známo, že katalyzuje site specific rekombinace událost mezi dvěma místy rozpoznávání DNA (Weby LoxP ). Toto rozpoznávací místo loxP 34 bazických párů (bp) se skládá ze dvou 13 bp palindromické sekvence které lemují 8bp distanční oblast. Výrobky z Cre zprostředkovaná rekombinace na loxP místech jsou závislé na umístění a relativní orientaci loxP míst. Dva oddělené druhy DNA, oba obsahující loxP místa, mohou podstoupit fúzi jako výsledek Cre zprostředkované rekombinace. Sekvence DNA nalezené mezi dvěma loxP místy jsou považovány za „floxovaný V tomto případě závisí produkty Cre zprostředkované rekombinace na orientaci loxP míst. DNA nalezená mezi dvěma loxP místy orientovanými ve stejném směru bude vyříznuta jako kruhová smyčka DNA, zatímco bude zasahovat do DNA mezi dvěma loxP místy, která jsou opačně orientovaný bude obrácen.[1] Enzym nevyžaduje žádné další kofaktory (např ATP ) nebo doplňkové proteiny pro svou funkci.[2]
Enzym hraje důležitou roli v životním cyklu Bakteriofág P1 jako je cyklizace lineárního genomu a rozlišení dimerního chromozomy ten formulář po replikace DNA.[3]
Cre rekombináza je široce používaný nástroj v oblasti molekulární biologie. Unikátní a specifický rekombinační systém enzymu je využíván k manipulaci s geny a chromozomy v široké škále výzkumů, jako je gen knock out nebo zatlouci studie. Schopnost enzymu efektivně fungovat v široké škále buněčných prostředí (včetně savců, rostlin, bakterií a kvasinek) umožňuje Cre-Lox rekombinace systém, který se používá v obrovském počtu organismů, což z něj činí obzvláště užitečný nástroj ve vědeckém výzkumu.[4]
Objev
Studie provedené v roce 1981 Sternbergem a Hamiltonem prokázaly, že bakteriofág „P1“ měl jedinečný místně specifický rekombinační systém. EcoRI fragmenty Bakteriofág P1 genom byly vygenerovány a naklonovaný do lambda vektory. 6,5 kB EcoRI Bylo zjištěno, že fragment (Fragment 7) umožňuje účinné rekombinační události.[5] Bylo známo, že mechanismus těchto rekombinačních událostí je jedinečný, protože k nim došlo za nepřítomnosti bakterií RecA a RecBCD bílkoviny. Složky tohoto rekombinačního systému byly objasněny pomocí delece mutageneze studie. Tyto studie ukázaly, že k tomu, aby došlo k účinným rekombinačním událostem, byl vyžadován produkt genu P1 a místo rekombinace. Byl pojmenován genový produkt P1 Cre (Causes rekombinace) a místo rekombinace bylo pojmenováno loxP (hlemísto přechodu (X) přes, P1).[5] Cre protein byl čištěn v roce 1983 a bylo zjištěno, že je to 35 000 Da protein.[2] Žádné vysokoenergetické kofaktory jako např ATP nebo doplňkové proteiny jsou vyžadovány pro rekombinázovou aktivitu purifikovaného proteinu.[2] Rané studie také prokázaly, že se Cre váže na nespecifické sekvence DNA, přičemž má 20krát vyšší afinitu k loxP sekvencím a výsledky časných Stopy DNA studie také naznačují, že molekuly Cre vážou loxP místa jako dimery.[2]
Členové rodiny tyrosin rekombinázy[3] |
---|
S. cerevisiae Flp rekombináza |
Bakteriální XerC rekombináza |
Bakteriální XerD rekombináza |
λ protein integrázy |
Protein HP1 integrázy |
Struktura
Cre rekombináza se skládá z 343 aminokyseliny které tvoří dvě odlišné domény. The amino terminál doména zahrnuje zbytky 20–129 a tato doména obsahuje 5 alfa šroubovice segmenty spojené řadou krátkých smyček. Helice A a E se podílejí na tvorbě rekombinázového tetrameru s C koncovou oblastí helixu E, o které je známo, že tvoří kontakty s C terminální doménou sousedních podjednotek. Helices B & D tvoří přímé kontakty s hlavní drážkou DNA loxP. Předpokládá se, že tyto dvě šroubovice navazují tři přímé kontakty na báze DNA v místě loxP. The karboxy terminál doména enzymu se skládá z aminokyselin 132–341 a skrývá Aktivní stránky enzymu. Celková struktura této domény sdílí velkou strukturální podobnost s doménou katalytická doména dalších enzymů stejné rodiny, jako jsou λ Integrase a HP1 Integrase. Tato doména má převážně spirálovitou strukturu s 9 odlišnými šroubovicemi (F-N). Terminální šroubovice (N) vyčnívá z hlavního těla karboxy domény a má se za to, že tato šroubovice hraje roli při zprostředkování interakcí s jinými podjednotkami. Krystalové struktury ukazují, že tato koncová N šroubovice zahrabává svůj hydrofobní povrch do akceptorové kapsy sousední podjednotky Cre.[6]
Účinkem struktury dvou domén je vytvoření svorky ve tvaru C, která uchopí DNA z opačných stran.[3]
Aktivní stránky
The Aktivní stránky enzymu Cre se skládá z konzervovaných katalytická triáda zbytky Arg 173, Jeho 289, Arg 292 i konzervované nukleofilní zbytky Tyr 324 a Trp 315. Na rozdíl od některých rekombinázových enzymů, jako je Flp rekombináza, Cre netvoří sdílené aktivní místo mezi samostatnými podjednotkami a všechny zbytky, které přispívají k aktivnímu místu, se nacházejí v jedné podjednotce. V důsledku toho, když se dvě molekuly Cre vážou na jednom místě loxP, jsou přítomna dvě aktivní místa. Rekombinace zprostředkovaná Cre vyžaduje vytvoření synapse, ve které se spojí dva komplexy Cre-LoxP za vzniku takzvaného tetrameru synapse, ve kterém jsou přítomny 4 odlišné aktivní místa.[6] Tyr 324 funguje jako nukleofil za vzniku kovalentní vazby 3’-fosfotyrosinu na DNA substrát. The scissile fosfát (fosfát cílený na nukleofilní útok v místě štěpení) je koordinován postranními řetězci 3 aminokyselina zbytky katalytická triáda (Arg 173, Jeho 289 & Trp 315). The indol dusík z tryptofan 315 také tvoří a vodíková vazba k tomuto scissilnímu fosfátu. (n.b A Histidin zabírá toto místo v jiných členech rodiny tyrosin rekombináz a vykonává stejnou funkci). Tato reakce štěpí DNA a uvolní 5 'hydroxylovou skupinu. K tomuto procesu dochází v aktivním místě dvou ze čtyř podjednotek rekombinázy přítomných na synapse tetrameru. Pokud 5 'hydroxylové skupiny zaútočí na 3'-fosfotyrosinovou vazbu, jeden pár řetězců DNA se vymění za vytvoření Křižovatka Holliday středně pokročilí.[3]
Aplikace
Role v bakteriofágu P1
Cre rekombináza hraje důležitou roli v životní cyklus z Bakteriofág P1. Po infekci buňky se systém Cre-loxP používá k cirkularizaci DNA P1. Kromě toho se Cre také používá k rozlišení dimerní lysogenní P1 DNA, která se tvoří během buněčného dělení fága.[7]
Použití ve výzkumu
Jednoduchost a robustnost systémů Cre-loxP umožnila vědcům využít enzym Cre za účelem manipulace s DNA jak in vivo, tak in vitro. Vidět Cre-Lox rekombinace Více podrobností. Enzym Cre lze exprimovat v mnoha různých organismech, jako jsou rostliny, bakterie, savci, kvasinky. V roce 1992 byl Cre exprimován a bylo zjištěno, že je funkční u myšího hostitele.[8][9] Promotér oblasti lze manipulovat tak, aby umožňovaly přesnou dočasnou kontrolu exprese enzymu Cre (např. RU486-citlivý chimérický regulátor GLVP).[10] Protože má enzym specifický 34bp DNA substrát, genom organismu by musel být 1018 bp na délku pro pravděpodobný výskyt loxP stránky. Protože savčí genomy jsou v průměru v oblasti 3×109 bp je velmi malá šance najít endogenní stránka loxP.[1] Aby Cre fungoval v cizím hostiteli, exogenní stránky loxP musí být vytvořeny. To umožňuje přesnou kontrolu nad aktivitou enzymu Cre v testovaných organismech.
Nezávisle, Joe Z. Tsien je průkopníkem v používání systému Cre-loxP pro neurovědecký výzkum k dosažení buněčné a regionálně specifické genové manipulace v dospělém mozku, kde mohou existovat stovky odlišných typů neuronů a téměř všechny neurony v dospělém mozku jsou v postmitotickém stavu. Tsien a jeho kolegové prokázali, že v postmitotických pyramidových neuronech v předním mozku dospělých může nastat Cre-zprostředkovaná rekombinace.[11] Jasná demonstrace jeho užitečnosti při přesném definování komplexního vztahu mezi specifickými buňkami / obvody a chováním pro výzkum mozku,[12] podpořila NIH, aby na začátku roku 2000 zahájil NIH Blueprint pro Neuroscience Research myši Cre-driver.[13][14] K dnešnímu dni vytvořily projekty NIH Blueprint pro Neuroscience Research Cre několik stovek linií myší ovladače Cre, které v současné době používá celosvětová komunita neurovědy.
Vylepšení
V posledních letech byla Cre rekombináza vylepšena přeměnou na preferovaného savce kodony, odstranění hlášené záhadné spojovací weby, změněno stop kodon a snížena Obsah CpG ke snížení rizika epigenetiky umlčení v savci.[15] Byla také identifikována řada mutantů se zvýšenou přesností.[16]
Viz také
Reference
- ^ A b Nagy A (únor 2000). "Cre rekombináza: univerzální činidlo pro přizpůsobení genomu". Genesis. 26 (2): 99–109. doi:10.1002 / (SICI) 1526-968X (200002) 26: 2 <99 :: AID-GENE1> 3.0.CO; 2-B. PMID 10686599.
- ^ A b C d Abremski K, Hoess R (únor 1984). „Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein“. The Journal of Biological Chemistry. 259 (3): 1509–1514. PMID 6319400.
- ^ A b C d Van Duyne GD (2001). "Strukturální pohled na site-specific rekombinaci cre-loxp". Roční přehled biofyziky a biomolekulární struktury. 30: 87–104. doi:10.1146 / annurev.biophys.30.1.87. PMID 11340053.
- ^ Ennifar E, Meyer JE, Buchholz F, Stewart AF, Suck D (září 2003). „Krystalová struktura divokého typu Cre rekombinázy-loxP synapse odhaluje novou konformační spacer naznačující alternativní mechanismus aktivace štěpení DNA“. Výzkum nukleových kyselin. 31 (18): 5449–5460. doi:10,1093 / nar / gkg732. PMC 203317. PMID 12954782.
- ^ A b Sternberg N, Hamilton D (srpen 1981). „Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between loxP sites“. Journal of Molecular Biology. 150 (4): 467–486. doi:10.1016/0022-2836(81)90375-2. PMID 6276557.
- ^ A b Guo F, Gopaul DN, van Duyne GD (září 1997). "Struktura Cre rekombinázy v komplexu s DNA v místně specifické rekombinační synapse". Příroda. 389 (6646): 40–46. Bibcode:1997 Natur.389 ... 40G. doi:10.1038/37925. PMID 9288963.
- ^ Shaikh AC, Sadowski PD (únor 1997). „Cre rekombináza štěpí místo loxu trans“. The Journal of Biological Chemistry. 272 (9): 5695–5702. doi:10.1074 / jbc.272.9.5695. PMID 9038180.
- ^ Lakso M, Sauer B, Mosinger B, Lee EJ, Manning RW, Yu SH, Mulder KL, Westphal H (červenec 1992). „Cílená aktivace onkogenu místně specifickou rekombinací u transgenních myší“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 89 (14): 6232–6236. Bibcode:1992PNAS ... 89.6232L. doi:10.1073 / pnas.89.14.6232. PMC 49474. PMID 1631115.
- ^ Orban PC, Chui D, Marth JD (srpen 1992). "Tkáňově a místně specifická rekombinace DNA u transgenních myší". Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 89 (15): 6861–6865. Bibcode:1992PNAS ... 89.6861O. doi:10.1073 / pnas.89.15.6861. PMC 49604. PMID 1495975.
- ^ Kyrkanides S, Miller JH, Bowers WJ, Federoff HJ (listopad 2003). „Transkripční a posttranslační regulace Cre rekombinázy pomocí RU486 jako základ pro vylepšený indukovatelný expresní systém“. Molekulární terapie. 8 (5): 790–795. doi:10.1016 / j.ymthe.2003.07.005. PMID 14599812.
- ^ Tsien a kol. (1996). "Vyřazení genu omezeného na podoblast a buněčný typ v mozkovém mozku". Buňka. 87 (7): 1317–26. doi:10.1016 / s0092-8674 (00) 81826-7. PMID 8980237.
- ^ Tsien JZ a kol. (1996b). „Základní role synaptické plasticity závislé na hipokampu CA1 NMDA receptoru v prostorové paměti“. Buňka. 87 (7): 1327–38. doi:10.1016 / s0092-8674 (00) 81827-9. PMID 8980238.
- ^ Plán NIH pro neurovědu: síť ovladačů Cre. http://www.neuroscienceblueprint.nih.gov/factSheet/CreDriver.htm
- ^ Mozkový projekt GENSAT, http://www.gensat.org/index.html
- ^ Shimshek DR, Kim J, Hübner MR, Spergel DJ, Buchholz F, Casanova E, Stewart AF, Seeburg PH, Sprengel R (leden 2002). Msgstr "Exprese Cre rekombinázy (iCre) s vylepšeným kodonem v myši". Genesis. 32 (1): 19–26. doi:10,1002 / gen. 10023. PMID 11835670.
- ^ Eroshenko N, Church GM (září 2013). "Mutanti Cre rekombinázy se zvýšenou přesností". Příroda komunikace. 4: 2509. Bibcode:2013NatCo ... 4.2509E. doi:10.1038 / ncomms3509. PMC 3972015. PMID 24056590.
externí odkazy
- Cre rekombináza v americké národní lékařské knihovně Lékařské předměty (Pletivo)