Genové cílení - Gene targeting

A chimérický myší gen zaměřený na gen aguti barvy srsti, s jeho potomky

Genové cílení (taky, náhradní strategie založená na homologní rekombinaci) je genetický technika, která používá homologní rekombinace upravit endogenní gen. Tuto metodu lze použít k odstranění genu, odstranění exony, přidat gen a upravit jednotlivé páry bází (zavést bodové mutace ). Genové cílení může být trvalé nebo podmíněné. Podmínky mohou být v určitou dobu rozvoj / život organismu nebo omezení na konkrétní tkáň, například. Genové cílení vyžaduje vytvoření konkrétního vektor pro každý sledovaný gen. Lze jej však použít pro jakýkoli gen, bez ohledu na transkripční aktivitu nebo velikost genu.

Metody

Obecně, DNA obsahující část genu, na který se má cílit, a reportér gen, a (dominantní) volitelná značka je sestaven v bakterie.

Metody genového cílení jsou zavedeny pro několik modelové organismy a může se lišit v závislosti na druh použitý. Zaměřit geny na myši, DNA je vložena do myši embryonální kmenové buňky v kultuře. Buňky s vložením mohou přispívat do tkáně myši prostřednictvím embryo injekce. Konečně, chimérický myši, kde modifikované buňky tvoří reprodukční orgány chován. Po tomto kroku je celé tělo myši založeno na vybrané embryonální kmenové buňce.

Divoký typ Physcomitrella a vyřazovací mechy: Odchylné fenotypy indukované u transformantů knihovny narušujících gen. Physcomitrella divokého typu a transformované rostliny byly pěstovány na minimálním Knopově médiu pro indukci diferenciace a vývoje gametofory. Pro každou rostlinu je zobrazen přehled (horní řada, měřítko odpovídá 1 mm) a detail (spodní řádek, měřítko odpovídá 0,5 mm). A, haploidní divoká rostlina mechu zcela pokrytá listovými gametofory a detail divokého listu. B-D, různé mutanty.[1]

Zaměřit geny na mech, DNA se inkubuje společně s čerstvě izolovanou protoplasty a s polyethylenglykol. Jako jsou mechy haploidní organismy,[2] mech vlákna (protonema ) lze přímo vyšetřit na cíl, a to buď ošetřením pomocí antibiotika nebo s PCR. Jedinečný mezi rostliny, tento postup pro reverzní genetika je stejně efektivní jako v droždí.[3] Genové cílení bylo úspěšně aplikováno na skot, ovce, prasata a mnoho hub.

Četnost genového cílení může být významně zvýšena použitím inženýrství endonukleázy jako nukleázy zinkového prstu,[4] inženýrství naváděcí endonukleázy,[5] a nukleázy založené na inženýrství TAL efektory.[6] Tato metoda byla aplikována na druhy včetně Drosophila melanogaster,[4] tabák,[7][8] kukuřice,[9] člověk buňky,[10] myši[11] a krysy.[11]

Srovnání s odchytem genů

Zachytávání genů je založen na náhodném vložení kazety, zatímco genové cílení manipuluje se specifickým genem. Kazety lze použít pro mnoho různých věcí, zatímco okrajové homologické oblasti kazet zaměřených na geny je třeba upravit pro každý gen. Díky tomu je zachycování genů snáze přístupné pro rozsáhlé projekty než pro cílení. Na druhou stranu lze genové cílení použít pro geny s nízkými transkripcemi, které by na detekční obrazovce nebyly detekovány. Pravděpodobnost zachycení se zvyšuje s intron velikost, zatímco pro cílení genů jsou malé geny stejně snadno pozměněny.

Aplikace

Genové cílení bylo široce používáno ke studiu lidských genetických chorob odstraněním ("vyřazení „) nebo přidání („ klepání “) konkrétních zajímavých mutací.[12] Pokroky v technologiích cílení na geny, které se dříve používaly k vývoji modelů krysích buněk, umožňují novou vlnu modely isogenních lidských onemocnění. Tyto modely jsou nejpřesnější in vitro modely dostupné výzkumným pracovníkům a usnadňující vývoj přizpůsobených léků a diagnostiky, zejména v EU onkologie.[13]

Nobelova cena za rok 2007

Mario R. Capecchi, Martin J. Evans a Oliver Smithies byly oceněny v roce 2007 Nobelova cena za fyziologii nebo medicínu za jejich práci na „principech zavedení specifických genových modifikací u myší pomocí embryonálních kmenových buněk“ nebo genové cílení.[14]

Viz také

Reference

  1. ^ Egener, T .; Granado, J .; Guitton, M. C .; Hohe, A .; Holtorf, H .; Lucht, J. M .; Rensing, S. A .; Schlink, K .; Schulte, J .; Schween, G .; Zimmermann, S .; Duwenig, E .; Rak, B .; Reski, R. (2002). „Vysoká frekvence fenotypových odchylek v rostlinách Physcomitrella patens transformovaných knihovnou narušení genů“. Biologie rostlin BMC. 2: 6. doi:10.1186/1471-2229-2-6. PMC  117800. PMID  12123528.
  2. ^ Ralf Reski (1998): Rozvoj,genetika a molekulární biologie z mechy. Botanica Acta 111, 1-15.
  3. ^ Ralf Reski (1998): Physcomitrella a Arabidopsis: David a Goliáš z reverzní genetika. Trends Plant in Science 3, 209-210. [1]
  4. ^ A b Bibikova, M .; Beumer, K .; Trautman, J .; Carroll, D. (2003). „Posílení genového cílení pomocí navržených nukleáz zinku“. Věda. 300 (5620): 764. doi:10.1126 / science.1079512. PMID  12730594. S2CID  42087531.
  5. ^ Grizot, S .; Smith, J .; Daboussi, F .; Prieto, J .; Redondo, P .; Merino, N .; Villate, M .; Thomas, S .; Lemaire, L .; Montoya, G .; Blanco, F. J .; Pâques, F .; Duchateau, P. (2009). „Efektivní cílení genu SCID pomocí inženýrsky navázané jednořetězcové naváděcí endonukleázy“. Výzkum nukleových kyselin. 37 (16): 5405–5419. doi:10.1093 / nar / gkp548. PMC  2760784. PMID  19584299.
  6. ^ Miller, J. C .; Tan, S .; Qiao, G .; Barlow, K. A .; Wang, J .; Xia, D.F .; Meng, X .; Paschon, D. E.; Leung, E .; Hinkley, S. J .; Dulay, G. P .; Hua, K. L .; Ankoudinova, I .; Cost, G. J .; Urnov, F. D .; Zhang, H. S .; Holmes, M. C .; Zhang, L .; Gregory, P. D .; Rebar, E. J. (2010). "TALE nukleázová architektura pro efektivní editaci genomu". Přírodní biotechnologie. 29 (2): 143–148. doi:10,1038 / nbt.1755. PMID  21179091. S2CID  53549397.
  7. ^ Cai, C. Q .; Doyon, Y .; Ainley, W. M .; Miller, J. C .; Dekelver, R. C .; Moehle, E. A .; Rock J. M .; Lee, Y. L .; Garrison, R .; Schulenberg, L .; Blue, R .; Worden, A .; Baker, L .; Faraji, F .; Zhang, L .; Holmes, M. C .; Rebar, E. J .; Collingwood, T. N .; Rubin-Wilson, B .; Gregory, P. D .; Urnov, F. D .; Petolino, J. F. (2008). "Cílená integrace transgenu v rostlinných buňkách pomocí navržených nukleáz se zinkovým prstem". Molekulární biologie rostlin. 69 (6): 699–709. doi:10.1007 / s11103-008-9449-7. ISSN  0167-4412. PMID  19112554.
  8. ^ Townsend, J. A .; Wright, D. A .; Winfrey, R. J .; Fu, F .; Maeder, M.L .; Joung, J. K .; Voytas, D. F. (2009). „Vysokofrekvenční modifikace rostlinných genů pomocí geneticky upravených nukleáz zinku“. Příroda. 459 (7245): 442–445. Bibcode:2009 Natur.459..442T. doi:10.1038 / nature07845. PMC  2743854. PMID  19404258.
  9. ^ Shukla, V. K .; Doyon, Y .; Miller, J. C .; Dekelver, R. C .; Moehle, E. A .; Worden, S.E .; Mitchell, J. C .; Arnold, N.L .; Gopalan, S .; Meng, X .; Choi, V. M .; Rock J. M .; Wu, Y. Y .; Katibah, G. E .; Zhifang, G .; McCaskill, D .; Simpson, M. A .; Blakeslee, B .; Greenwalt, S. A .; Butler, H. J .; Hinkley, S. J .; Zhang, L .; Rebar, E. J .; Gregory, P. D .; Urnov, F. D. (2009). „Přesná modifikace genomu u druhů plodin Zea mays pomocí nukleáz se zinkovým prstem“. Příroda. 459 (7245): 437–441. Bibcode:2009 Natur.459..437S. doi:10.1038 / nature07992. PMID  19404259.
  10. ^ Urnov, F. D .; Miller, J. C .; Lee, Y. L .; Beausejour, C. M .; Rock J. M .; Augustus, S .; Jamieson, A. C .; Porteus, M. H .; Gregory, P. D .; Holmes, M. C. (2005). „Vysoce účinná endogenní korekce lidského genu pomocí navržených nukleáz zinkového prstu“. Příroda. 435 (7042): 646–651. Bibcode:2005 Natur.435..646U. doi:10.1038 / nature03556. PMID  15806097.
  11. ^ A b Cui, X .; Ji, D .; Fisher, D. A .; Wu, Y .; Briner, D. M .; Weinstein, E. J. (2010). "Cílená integrace u embryí potkanů ​​a myší s nukleázami se zinkovým prstem". Přírodní biotechnologie. 29 (1): 64–7. doi:10.1038 / nbt.1731. PMID  21151125.
  12. ^ Fanelli, Alex (2017). „Aplikace xenograftu“. Xenograft.net. Citováno 15. ledna 2018.
  13. ^ Sur, Surojit; Pagliarini, Raymond; Bunz, Fred; Rago, Carlo; Diaz, Luis A .; Kinzler, Kenneth W .; Vogelstein, Bert; Papadopoulos, Nickolas (10.03.2009). „Skupina isogenních lidských rakovinných buněk navrhuje terapeutický přístup pro rakoviny s inaktivovaným p53“. Sborník Národní akademie věd. 106 (10): 3964–3969. Bibcode:2009PNAS..106.3964S. doi:10.1073 / pnas.0813333106. PMC  2656188. PMID  19225112.
  14. ^ „Tisková zpráva: Nobelova cena za fyziologii nebo medicínu za rok 2007“. Citováno 2007-10-08.
  15. ^ Vyřazení genu Arabidopsis: hledané fenotypy

externí odkazy