Floxing - Floxing

Tento obrázek ukazuje, jak se Floxing používá ve vědeckém výzkumu pro prostorovou a časovou kontrolu genové exprese.

V genetice floxování označuje sendvičování a DNA sekvence (o které se pak říká, že je floxovaný) mezi dvěma lox P stránky. Termíny jsou konstruovány na frázi „lemující / lemovaný LoxP“. Rekombinace mezi místy LoxP je katalyzován Cre rekombináza. Floxing genu umožňuje, aby byl odstraněn (vyřazen), přemístěn nebo invertován v procesu zvaném Cre-Lox rekombinace. [1] Floxace genů je nezbytná při vývoji vědeckých modelových systémů, protože umožňuje vědcům prostorovou a časovou změnu genové exprese.[2] Kromě toho mohou být zvířata, jako jsou myši, použita jako modely ke studiu lidských onemocnění. Proto může být systém Cre-lox použit u myší k manipulaci genové exprese za účelem studia lidských nemocí a vývoje léků.[3] Například pomocí systému Cre-lox mohou vědci studovat onkogeny a supresor nádoru geny a jejich role ve vývoji a progresi genů rakovina v modelech myší.[4]

Využití ve výzkumu

Floxování genu umožňuje jeho vymazání (vyřazení),[5][6] přemístěn nebo vložen[7] (prostřednictvím různých mechanismů v rekombinaci Cre-Lox).

Floxace genů je nezbytná při vývoji vědeckých modelových systémů, protože umožňuje prostorovou a časovou změnu genové exprese. Laicky řečeno, gen může být vyřazen (inaktivován) ve specifické tkáni in vivo, kdykoli si to zvolí vědec. Vědec pak může vyhodnotit účinky vyřazeného genu a identifikovat normální funkci genu[8]. To se liší od nepřítomnosti genu od početí, přičemž inaktivace nebo ztráta genů, které jsou nezbytné pro vývoj organismu, mohou interferovat s normální funkcí buněk a bránit produkci životaschopných potomků.[9]

Mechanismus výmazu

Modelový experiment v genetice využívající systém Cre-lox: předčasná stop sekvence přítomná u floxovaných myší je odstraněna pouze z buněk, které exprimují Cre rekombinázu, když jsou myši chovány společně.

Události odstranění jsou užitečné pro provádění experimentů s úpravou genů prostřednictvím přesné úpravy segmentů nebo dokonce celých genů. Vymazání vyžaduje floxaci segmentu zájmu s loxP weby, které směřují stejným směrem. Cre rekombináza detekuje jednosměrná loxP místa a vyřízne floxovaný segment DNA.[10] Úspěšně upravené klony lze vybrat pomocí značky výběru, kterou lze odstranit pomocí stejného systému Cre-loxP.[10] Stejný mechanismus lze použít k vytvoření podmíněné alely zavedením FRT / Flp místo, které dosahuje stejného mechanismu, ale s jiným enzymem.

Mechanismus inverze

Inverzní události jsou užitečné pro udržení množství genetického materiálu. Invertované geny nejsou často spojovány s abnormálními fenotypy, což znamená, že invertované geny jsou obecně životaschopné.[11] Rekombinace Cre-loxP, která má za následek inzerci, vyžaduje, aby loxP místa floxovala požadovaný gen, s loxP místy orientovanými k sobě. Podstoupením Cre rekombinace se oblast floxovaná loxP weby obrátí,[12] tento proces není trvalý a lze ho zvrátit.[13]  

Mechanismus translokace

K translokačním událostem dochází, když loxP místa floxují geny na dvou různých molekulách DNA v jednosměrné orientaci. Cre rekombináza se poté použije ke generování translokace mezi dvěma molekulami DNA a výměně genetického materiálu z jedné molekuly DNA za druhou za vzniku simultánní translokace obou floxovaných genů.[14][15]

Společné aplikace ve výzkumu

Kardiomyocyty Bylo prokázáno, že (tkáň srdečního svalu) exprimují typ Cre rekombinázy, která je vysoce specifická pro kardiomyocyty a mohou ji vědci použít k provedení vysoce účinných rekombinací. Toho je dosaženo použitím typu Cre, jehož výraz je řízen - promotor těžkého řetězce myosinu (-MyHC). Tyto rekombinace jsou schopné narušit geny způsobem, který je specifický pouze pro srdeční tkáň in vivo a umožňuje vytvoření podmíněných knockoutů srdce většinou pro použití jako kontroly.[16]

Například pomocí Cre rekombináza s -MyHC promotor způsobuje, že se floxovaný gen inaktivuje pouze v srdci. Dále mohou být tyto knockouty indukovatelné. V několika studiích na myších tamoxifen se používá k vyvolání Cre rekombináza.[17][18] V tomto případě, Cre rekombináza je spojena s částí myši estrogenový receptor (ER), který obsahuje mutaci uvnitř doména vázající ligand (LBD). Díky mutaci je receptor neaktivní, což vede k nesprávné lokalizaci prostřednictvím jeho interakcí s chaperonovými proteiny, jako je protein 70 a 90 tepelného šoku (Hsp70 a Hsp90 ). Tamoxifen se váže na Cre-ER a narušuje jeho interakce s chaperony, což umožňuje fúznímu proteinu Cre-ER vstoupit do jádra a provést rekombinaci na floxovaném genu.[19][20] Dodatečně, Cre rekombináza mohou být indukovány teplem, pokud jsou pod kontrolou specifických prvků tepelného šoku (HSE).[21][22]

Reference

  1. ^ Nagy A (únor 2000). "Cre rekombináza: univerzální činidlo pro přizpůsobení genomu". Genesis. 26 (2): 99–109. doi:10.1002 / (SICI) 1526-968X (200002) 26: 2 <99 :: AID-GENE1> 3.0.CO; 2-B. PMID  10686599. S2CID  2916710.
  2. ^ Hayashi S, McMahon AP (duben 2002). „Efektivní rekombinace v různých tkáních formou tamoxifenem indukovatelné formy Cre: nástroj pro časově regulovanou aktivaci / inaktivaci genů u myší“. Vývojová biologie. 244 (2): 305–18. doi:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  3. ^ Genetika myší: metody a protokoly. Singh, Shree Ram ,, Coppola, Vincenzo. New York, NY. ISBN  9781493912155. OCLC  885338722.CS1 maint: ostatní (odkaz)
  4. ^ Green JE, Ried T (2012). Geneticky upravené myši pro výzkum rakoviny. doi:10.1007/978-0-387-69805-2. ISBN  978-0-387-69803-8.
  5. ^ Friedel RH, Wurst W, Wefers B, Kühn R (2011). "Generování podmíněných knockout myší". Metody a protokoly transgenních myší. Metody v molekulární biologii. 693. str. 205–31. doi:10.1007/978-1-60761-974-1_12. ISBN  978-1-60761-973-4. PMID  21080282.
  6. ^ Sakamoto K, Gurumurthy CB, Wagner K (2014), Singh SR, Coppola V (eds.), „Generation of Conditional Knockout Myši“, Genetika myší, Springer New York, 1194, str. 21–35, doi:10.1007/978-1-4939-1215-5_2, ISBN  9781493912148, PMID  25064096
  7. ^ Imuta Y, Kiyonari H, Jang CW, Behringer RR, Sasaki H (březen 2013). „Generace knock-in myší, které exprimují jaderně zesílený zelený fluorescenční protein a tamoxifenem indukovatelnou Cre rekombinázu v notochordu z Foxa2 a T loci“. Genesis. 51 (3): 210–8. doi:10.1002 / dvg.22376. PMC  3632256. PMID  23359409.
  8. ^ Hala B, Limaye A, Kulkarni AB (září 2009). "Přehled: generace genových knockoutovaných myší". Současné protokoly v buněčné biologii. Kapitola 19: Jednotka 19.12 19.12.1–17. doi:10.1002 / 0471143030.cb1912s44. PMC  2782548. PMID  19731224.
  9. ^ Rodrigues JV, Shakhnovich EI (2019-08-01). „Adaptace na mutační inaktivaci esenciálního genu E. coli konverguje k dostupnému suboptimálnímu vrcholu fitness“. bioRxiv: 552240. doi:10.1101/552240.
  10. ^ A b Schwenk F, Baron U, Rajewsky K (prosinec 1995). „Kre-transgenní myší kmen pro všudypřítomnou deleci genových segmentů lemovaných loxP včetně delece v zárodečných buňkách“. Výzkum nukleových kyselin. 23 (24): 5080–1. doi:10.1093 / nar / 23.24,5080. PMC  307516. PMID  8559668.
  11. ^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). „Inverze“. Úvod do genetické analýzy. 7. vydání.
  12. ^ Xu J, Zhu Y (srpen 2018). „Rychlá metoda in vitro k převrácení obráceného otevřeného čtecího rámce s dvojitým floxem v plazmidu“. BMC biotechnologie. 18 (1): 52. doi:10.1186 / s12896-018-0462-x. PMC  6119287. PMID  30170595.
  13. ^ Oberdoerffer P, Otipoby KL, Maruyama M, Rajewsky K (listopad 2003). „Jednosměrná Cre zprostředkovaná genetická inverze u myší pomocí mutantního páru loxP lox66 / lox71“. Výzkum nukleových kyselin. 31 (22): 140e – 140. doi:10.1093 / nar / gng140. PMC  275577. PMID  14602933.
  14. ^ Xu J, Zhu Y (srpen 2018). „Rychlá metoda in vitro k převrácení obráceného otevřeného čtecího rámce s dvojitým floxem v plazmidu“. BMC biotechnologie. 18 (1): 52. doi:10.1186 / s12896-018-0462-x. PMC  6119287. PMID  30170595.
  15. ^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (2000). "Translokace". Úvod do genetické analýzy (7. vydání).
  16. ^ Pugach EK, Richmond PA, Azofeifa JG, Dowell RD, Leinwand LA (září 2015). „Prodloužená exprese Cre řízená promotorem těžkého řetězce α-myosinu může být kardiotoxická“. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86: 54–61. doi:10.1016 / j.yjmcc.2015.06.019. PMC  4558343. PMID  26141530.
  17. ^ Hayashi S, McMahon AP (duben 2002). „Efektivní rekombinace v různých tkáních formou tamoxifenem indukovatelné formy Cre: nástroj pro časově regulovanou aktivaci / inaktivaci genů u myší“. Vývojová biologie. 244 (2): 305–18. doi:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  18. ^ Hayashi S, McMahon AP (duben 2002). „Efektivní rekombinace v různých tkáních formou tamoxifenem indukovatelné formy Cre: nástroj pro časově regulovanou aktivaci / inaktivaci genů u myší“. Vývojová biologie. 244 (2): 305–18. doi:10.1006 / dbio.2002.0597. PMID  11944939.
  19. ^ Danielian PS, Muccino D, Rowitch DH, Michael SK, McMahon AP (prosinec 1998). "Modifikace genové aktivity v myších embryích in utero formou tamoxifenem indukovatelné formy Cre rekombinázy". Aktuální biologie. 8 (24): 1323–6. doi:10.1016 / s0960-9822 (07) 00562-3. PMID  9843687.
  20. ^ Techniky transgeneze: principy a protokoly. Clarke, Alan R. (2. vyd.). Totowa, NJ: Humana Press. 2002. ISBN  9781592591787. OCLC  50175106.CS1 maint: ostatní (odkaz)
  21. ^ Rakovina a zebrafish: mechanismy, techniky a modely. Langenau, David M. Švýcarsko. ISBN  9783319306544. OCLC  949668674.CS1 maint: ostatní (odkaz)
  22. ^ Kobayashi K, Kamei Y, Kinoshita M, Czerny T, Tanaka M (leden 2013). "Tepelně indukovatelný systém indukce genu CRE / LOXP v Medace". Genesis. 51 (1): 59–67. doi:10.1002 / dvg.22348. PMID  23019184.