Stanovení kyseliny bicinchoninové - Bicinchoninic acid assay - Wikipedia
The Stanovení kyseliny bicinchoninové (Stanovení BCA), také známý jako Smithův test, po svém vynálezci, Paul K. Smith na Pierce Chemical Company,[1] nyní součást Thermo Fisher Scientific, je a biochemické test pro stanovení celkové koncentrace protein v roztoku (0,5 μg / ml až 1,5 mg / ml), podobně jako Lowryho proteinový test, Bradfordův proteinový test nebo biuretové činidlo. Celková koncentrace proteinu se projevuje změnou barvy roztoku vzorku ze zelené na fialovou v poměru k koncentraci proteinu, kterou lze poté změřit pomocí kolorimetrický techniky.
Mechanismus
Zásobní roztok BCA obsahuje následující složky ve vysoké míře zásaditý řešení s a pH 11.25: kyselina bicinchoninová, uhličitan sodný, hydrogenuhličitan sodný, vinan sodný, a síran měďnatý pentahydrát.
Stanovení BCA se primárně opírá o dvě reakce. Nejprve peptidové vazby v bílkovinách snížit Cu2+ ionty ze síranu měďnatého na Cu+ (reakce závislá na teplotě). Množství Cu2+ redukovaný je úměrný množství proteinu přítomného v roztoku. Dále dvě molekuly kyseliny bicinchoninové chelátovat s každým Cu+ ion, tvořící fialově zbarvený komplex, který silně absorbuje světlo v a vlnová délka z 562 nm.
Bicinchoninová kyselina Cu+ komplex je ovlivněn ve vzorcích proteinů přítomností postranních řetězců cystein / cystin, tyrosin a tryptofan. Při vyšších teplotách (37 až 60 ° C) pomáhají peptidové vazby při tvorbě reakčního komplexu. Inkubace testu BCA při vyšších teplotách se doporučuje jako způsob, jak zvýšit citlivost testu při minimalizaci odchylek způsobených nerovnoměrným složením aminokyselin.[2]
Množství proteinu přítomného v roztoku lze kvantifikovat měřením absorpční spektra a srovnání s proteinovými roztoky známé koncentrace.
Viz také
Reference
- ^ Smith, P.K .; et al. (1985). "Měření bílkovin pomocí kyseliny bicinchoninové". Anální. Biochem. 150 (1): 76–85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7. PMID 3843705.
- ^ Olsen BJ, Markwell J (2007). „Stanovení pro stanovení koncentrace bílkovin“ (PDF). Současné protokoly ve vědě o bílkovinách: 14–17.
- Wiechelman, K .; Braun, R. a Fitzpatrick, J. (1988). „Vyšetřování testu na protein s kyselinou bicinchoninovou: Identifikace skupin odpovědných za tvorbu barvy“. Anální. Biochem. 175 (1): 231–7. doi:10.1016/0003-2697(88)90383-1. PMID 3245570.
- Stoscheck, CM. (1990). "Kvantifikace bílkovin". Metody v enzymologii. 182: 50–69. doi:10.1016 / 0076-6879 (90) 82008-P. ISBN 9780121820831. PMID 2314256.