Stopy bílkovin - Protein footprinting
Stopy bílkovin je termín používaný k označení metody biochemické analýzy, která zkoumá proteinová struktura, montáž a interakce v rámci většího makromolekulární sestava. Původně byl vytvořen v odkazu na použití omezené proteolýzy ke zkoumání kontaktních míst v komplexu monoklonální protilátka - proteinový antigen[1] a o rok později zkoumat ochranu před štěpením hydroxylovými radikály způsobenou proteinem vázaným na DNA v komplexu DNA-protein.[2] v Stopy DNA předpokládá se, že protein vytvoří otisk (nebo stopa ) v určitém bodě interakce.[3] Tato druhá metoda byla upravena přímým zpracováním proteinů a jejich komplexů s hydroxyl radikály.[4][5]
Stopy bílkovin hydroxylových radikálů
Časově vyřešeno hydroxylový radikál proteinová stopa využívající hmotnostní spektrometrie analýza byla vyvinuta koncem 90. let v roce 2006 synchrotron studie radiolýzy.[6][7] Ve stejném roce tito autoři informovali o použití elektrický výboj zdroj k ovlivnění oxidace proteinů v milisekundových časových intervalech, jak proteiny přecházejí z elektrospreje do hmotnostního spektrometru.[8]Tyto přístupy se od té doby používají ke stanovení proteinových struktur,[9] skládání proteinů, dynamika proteinů a interakce protein-protein.[10]
Na rozdíl od nukleových kyselin proteiny v těchto časových měřítcích spíše oxidují, než štěpí. Analýza produktů hmotnostní spektrometrií ukazuje, že proteiny jsou oxidovány omezeným způsobem (přibližně 10–30% celkového proteinu) na řadě aminokyselinových postranních řetězců napříč proteiny. Rychlost nebo úroveň oxidace na postranních řetězcích reaktivních aminokyselin (Met, Cys, Trp, Tyr, Phe, His, Pro a Leu) poskytuje míru jejich přístupnosti k objemovému rozpouštědlu. Mechanismy oxidace postranního řetězce byly prozkoumány provedením radiolyzačních reakcí v 18O-značená voda.
Produkuje OH radikály
Kritickým rysem těchto experimentů je potřeba vystavit proteiny hydroxylovým radikálům po omezenou dobu v řádu 1–50 ms, což vyvolá 10-30% oxidaci celkového proteinu. Dalším požadavkem je generovat hydroxylové radikály z objemového rozpouštědla (tj. Vody) (rovnice 1 a 2), nikoli z peroxidu vodíku, který může zůstat oxidovat proteiny i bez dalších stimulů.[11]
- H2O → H2Ó+• + e− + H2Ó*
- H2Ó+• + H2O → H3Ó+ + OH•
Hydroxylové radikály mohou být vyráběny v roztoku elektrickým výbojem v konvenčním zdroji ionizace elektrosprejem za atmosférického tlaku (ESI). Je-li mezi elektrosprejovou jehlou a odběrným otvorem pro hmotnostní analyzátor udržován rozdíl vysokého napětí (~ 8 keV), mohou být na špičce elektrosprejové jehly vytvářeny radikály v roztoku. Tato metoda byla poprvé použita k aplikaci proteinové stopy při studiu proteinového komplexu.[12]
Metoda
Vystavení proteinů „bílému“ rentgenovému paprsku synchrotronového světla nebo elektrickému výboji po desítky milisekund poskytuje dostatečnou oxidační modifikaci povrchových aminokyselinových postranních řetězců bez poškození proteinové struktury. Tyto produkty lze snadno detekovat a kvantifikovat hmotnostní spektrometrií. Úpravou času pro radiolýzu nebo toho, které proteinové ionty tráví ve výbojovém zdroji, je možný časově rozlišený přístup, který je cenný pro studium dynamiky proteinů.
Analýza
Byl také vytvořen počítačový program (PROXIMO), který pomáhá modelovat proteinové komplexy pomocí dat z RP-MS / Protein footprinting.[13] Studie stopy RP-MS / Protein proteinových komplexů mohou také použít výpočetní přístupy, které pomohou s tímto modelováním.[14]
Aplikace
Aplikace hmotnostní spektrometrie iontové mobility přesvědčivě prokázala, že podmínky použité v RP-MS / Proteinových stopových experimentech nemění strukturu proteinů.[15]
Další studie rozšířily tuto metodu o studium poškození proteinů s časným nástupem vzhledem k radikálnímu základu metody a významu radikálů na bázi kyslíku v patogenezi mnoha chorob, včetně neurologických poruch a dokonce i slepoty.[16]
Viz také
Reference
- ^ Sheshberadaran, H; L G Payne (1988). "Kontaktní místa proteinového antigenu a monoklonální protilátky vyšetřována omezenou proteolýzou antigenu vázaného na monoklonální protilátku: protein" stopa"". Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 85 (1): 1–5. Bibcode:1988PNAS ... 85 .... 1S. doi:10.1073 / pnas.85.1.1. PMC 279469. PMID 2448767. Citováno 2013-09-15.
- ^ Shafer GE, Price MA, Tullius TD (1989). "Použití hydroxylového radikálu a gelové elektroforézy ke studiu struktury DNA". Elektroforéza. 10 (5–6): 397–404. doi:10,1002 / elps.1150100518. PMID 2504579.
- ^ Galas, David J (2001). "Vynález stopy". Trendy v biochemických vědách. 26 (11): 690–693. doi:10.1016 / S0968-0004 (01) 01979-X. ISSN 0968-0004. PMID 11701330.
- ^ Maleknia, Simin D .; Downard, Kevin M. (2014). „Pokroky v hmotnostní spektrometrii radikální sondy pro stopu proteinů v aplikacích chemické biologie“. Recenze chemické společnosti. 43 (10): 3244–3258. doi:10.1039 / C3CS60432B. PMID 24590115.
- ^ Wang, Liwen; Šance, Mark R. (2011). „Strukturní hmotnostní spektrometrie proteinů využívajících stopu hydroxylového radikálového proteinu“. Analytická chemie. 83 (19): 7234–7241. doi:10.1021 / ac200567u. ISSN 0003-2700. PMC 3184339. PMID 21770468.
- ^ Maleknia, Simin D .; Brenowitz, Michael; Šance, Mark R. (1999). "Milisekundová radiolytická modifikace peptidů pomocí synchrotronových rentgenových paprsků identifikovaných hmotnostní spektrometrií". Analytická chemie. 71 (18): 3965–3973. doi:10.1021 / ac990500e. ISSN 0003-2700. PMID 10500483.
- ^ Maleknia, Simin D .; Ralston, Corie Y .; Brenowitz, Michael D .; Downard, Kevin M .; Šance, Mark R. (2001). "Stanovení makromolekulárního složení a struktury technikami rentgenové radiolýzy Synchrotron". Analytická biochemie. 289 (2): 103–115. doi:10.1006 / abio.2000.4910. ISSN 0003-2697. PMID 11161303.
- ^ Maleknia, Simin D .; Šance, Mark R .; Downard, Kevin M. (1999). „Modifikace proteinů podporovaná elektrosprejem: radikální sonda proteinové struktury“. Rychlá komunikace v hmotnostní spektrometrii. 13 (23): 2352–2358. Bibcode:1999RCMS ... 13,2352 mil. doi:10.1002 / (SICI) 1097-0231 (19991215) 13:23 <2352 :: AID-RCM798> 3.0.CO; 2-X. ISSN 0951-4198. PMID 10567934.
- ^ Maleknia, Simin D .; Kiselar, Janna G .; Downard, Kevin M. (2002). "Hydroxylová radikální sonda povrchu lysozymu synchrotronovou radiolýzou a hmotnostní spektrometrií". Rychlá komunikace v hmotnostní spektrometrii. 16 (1): 53–61. Bibcode:2002RCMS ... 16 ... 53M. doi:10,1002 / rcm. 543. ISSN 0951-4198. PMID 11754247.
- ^ Maleknia, Simin D .; Downard, Kevin M. (2001). "Radikální přístupy ke zkoumání struktury proteinů, skládání a interakcí hmotnostní spektrometrií". Recenze hmotnostní spektrometrie. 20 (6): 388–401. Bibcode:2001MSRv ... 20..388M. doi:10,1002 / mas. 10013. ISSN 0277-7037. PMID 11997945.
- ^ Kevin Downard (24. srpna 2007). Hmotnostní spektrometrie interakcí proteinů. John Wiley & Sons. ISBN 978-0-470-14632-3. Citováno 14. září 2013.
- ^ Wong, Jason W. H .; Maleknia, Simin D .; Downard, Kevin M. (2003). „Studium komplexu ribonukleázy - S - protein - peptid pomocí radikální sondy a hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem“. Analytická chemie. 75 (7): 1557–1563. doi:10.1021 / ac026400h. ISSN 0003-2700. PMID 12705585.
- ^ Gerega, S.K .; Downard, K. M. (2006). „PROXIMO - nový dokovací algoritmus pro modelování proteinových komplexů pomocí dat z hmotnostní spektrometrie radikální sondy (RP-MS)“. Bioinformatika. 22 (14): 1702–1709. doi:10.1093 / bioinformatika / btl178. ISSN 1367-4803. PMID 16679333.
- ^ Downard, Kevin M .; Kokabu, Yuichi; Ikeguchi, Mitsunori; Akashi, Satoko (2011). „Homologií modelovaná struktura βB2B3-krystalinového heterodimeru studovaná iontovou mobilitou a radikální sondou MS“. FEBS Journal. 278 (21): 4044–4054. doi:10.1111 / j.1742-4658.2011.08309.x. ISSN 1742-464X. PMID 21848669.
- ^ Downard, Kevin M .; Maleknia, Simin D .; Akashi, Satoko (2012). "Dopad omezené oxidace na mobilitu proteinových iontů a strukturu důležitou pro stopu pomocí hmotnostní spektrometrie radikální sondy". Rychlá komunikace v hmotnostní spektrometrii. 26 (3): 226–230. doi:10,1002 / rcm. 5320. ISSN 0951-4198. PMID 22223306.
- ^ Shum, Wai-Kei; Maleknia, Simin D .; Downard, Kevin M. (2005). „Nástup oxidačního poškození v α-krystalinu hmotnostní spektrometrií radikální sondy“. Analytická biochemie. 344 (2): 247–256. doi:10.1016 / j.ab.2005.06.035. ISSN 0003-2697. PMID 16091281.