Test ligace proximity - Proximity ligation assay

Obrázek 1: PLA začíná vazbou protilátek z různých druhů na 2 požadované proteiny, v tomto případě protein * (hvězda) a protein #

Test ligace proximity (in situ PLA) je technologie který rozšiřuje možnosti tradičních imunotesty zahrnout přímou detekci bílkoviny, proteinové interakce a posttranslační úpravy s vysokou specificitou a citlivostí.[1] Proteinové cíle lze snadno detekovat a lokalizovat pomocí rozlišení jedné molekuly a objektivně kvantifikovat v nemodifikovaných buňkách a tkáních. Použitím pouze několika buněk se subcelulární události, dokonce i přechodné nebo slabé interakce, odhalí in situ a subpopulace buněk mohou být diferencovány. Během několika hodin, výsledky z konvenčních koimunoprecipitace a techniky společné lokalizace lze potvrdit.[2]

Princip PLA

Obrázek 2: Vazba PLA sond.

Dva primární protilátky chovaných v různých druzích rozpoznat cíl antigen na sledovaných proteinech (obrázek 1). Sekundární protilátky (2Ó Ab) namířené proti konstantní oblasti různých primárních protilátek, nazývaných sondy PLA, se váží na primární protilátky (obrázek 2).

Obrázek 3: Spustí se syntéza DNA v kruhu.

Každá ze sond PLA má specifickou krátkou sekvenci Řetězec DNA připojený k tomu. Pokud jsou sondy PLA v blízkosti (tj. Pokud jsou dva původní požadované proteiny v blízkosti nebo v části proteinového komplexu, jak je znázorněno na obrázcích), mohou se řetězce DNA účastnit valivý kruh Syntéza DNA po přidání dvou dalších sekvenčně specifických DNA oligonukleotidů společně s příslušnými substráty a enzymy (obrázek 3).

Obrázek 4: Fluorescenční sondy se vážou na amplifikovanou DNA.

Výsledkem reakce syntézy DNA je několikanásobné zesílení kruhu DNA. Dále se přidají fluorescenčně značené komplementární oligonukleotidové sondy, které se vážou na amplifikovanou DNA (obrázek 4). Výsledná vysoká koncentrace fluorescence je snadno viditelný jako zřetelný jasný bod při pohledu s fluorescenční mikroskop.[3] V konkrétním zobrazeném případě (obrázek 5) se zobrazí jádro je zvětšen, protože se jedná o B-buňku lymfom buňka. Dva zájmové proteiny jsou a Receptor B buněk a MYD88. Nález interakce v cytoplazmě byl zajímavý, protože se předpokládá, že receptory B buněk se nacházejí v buněčné membráně.[4]

Obrázek 5: Obraz fluorescenční mikroskopie ukazující interakci proteinů v cytoplazmě. Nucleus v modré barvě, produkt PLA v červené barvě.

Aplikace

PLA, jak je popsáno výše, byla použita ke studiu aspektů vývoj zvířat[5][6] a rakovina prsu[7][8] mezi mnoha dalšími tématy. Ke studiu asociace proteinu a byla použita variace techniky (rISH-PLA) RNA.[9] Další variace PLA in situ zahrnuje multiplexní PLA test, který umožňuje paralelní vizualizaci více proteinových komplexů[10]. PLA lze také kombinovat s jinými čtecími formami, jako je ELISA,[11] průtoková cytometrie.[12][13] a Western blot[14]

Reference

  1. ^ Gullberg M, Gústafsdóttir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S (červen 2004). "Detekce cytokinů pomocí ligace proximity na základě protilátek". Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 101 (22): 8420–4. Bibcode:2004PNAS..101,8420G. doi:10.1073 / pnas.0400552101. PMC  420409. PMID  15155907.
  2. ^ Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, Landegren U (prosinec 2006). "Přímé pozorování jednotlivých komplexů endogenních proteinů in situ pomocí ligace blízkosti". Přírodní metody. 3 (12): 995–1000. doi:10.1038 / nmeth947. PMID  17072308. S2CID  21819907.
  3. ^ Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Fredriksson S, Gullberg M, Söderberg O, Jarvius M, Jarvius J, Howell M, Landegren U (říjen 2005). "Testy ligace proximity pro citlivé a specifické analýzy proteinů". Analytická biochemie. 345 (1): 2–9. doi:10.1016 / j.ab.2005.01.018. PMID  15950911.
  4. ^ Staudt, Louis. „Terapie lymfomu inspirovaná funkční a strukturní genomikou“. videocast.nih.gov. Národní institut zdraví. Citováno 3. února 2017.
  5. ^ Wang S, Yoo S, Kim HY, Wang M, Zheng C, Parkhouse W, Krieger C, Harden N (leden 2015). „Detekce komplexů protein-protein in situ v neuromuskulárním spojení larev Drosophila pomocí testu ligace blízkosti“. Žurnál vizualizovaných experimentů (95): 52139. doi:10.3791/52139. PMC  4354543. PMID  25650626.
  6. ^ Kwon J, Jeong SM, Choi I, Kim NH (2016). „ADAM10 se podílí na sestavování buněčných spojů v raném vývoji embrya prasat“. PLOS ONE. 11 (4): e0152921. Bibcode:2016PLoSO..1152921K. doi:10.1371 / journal.pone.0152921. PMC  4820119. PMID  27043020.
  7. ^ Karamouzis MV, Dalagiorgou G, Georgopoulou U, Nonni A, Kontos M, Papavassiliou AG (únor 2016). „Cílení HER-3 mění dimerizační vzorec členů rodiny proteinů ErbB v karcinomech prsu“. Cílový cíl. 7 (5): 5576–97. doi:10,18632 / oncotarget.6762. PMC  4868707. PMID  26716646.
  8. ^ Vincent A, Berthel E, Dacheux E, Magnard C, Venezia NL (duben 2016). „BRCA1 ovlivňuje signalizaci proteinové fosfatázy 6 prostřednictvím své interakce s ANKRD28“. The Biochemical Journal. 473 (7): 949–60. doi:10.1042 / BJ20150797. PMID  27026398.
  9. ^ Roussis IM, Guille M, Myers FA, Scarlett GP (2016). „Test hybridizace RNA na místě in situ hybridizace Proximity Ligation (rISH-PLA), test pro detekci komplexů RNA-protein v intaktních buňkách“. PLOS ONE. 11 (1): e0147967. Bibcode:2016PLoSO..1147967R. doi:10.1371 / journal.pone.0147967. PMC  4732756. PMID  26824753.
  10. ^ Leuchowius KJ, Clausson CM, Grannas K, Erbilgin Y, Botling J, Zieba A a kol. (Červen 2013). "Paralelní vizualizace více proteinových komplexů v jednotlivých buňkách v nádorové tkáni". Molekulární a buněčná proteomika. 12 (6): 1563–71. doi:10,1074 / mcp.O112.023374. PMC  3675814. PMID  23436906.
  11. ^ Ebai T, Souza de Oliveira FM, Löf L, Wik L, Schweiger C, Larsson A a kol. (Září 2017). „Analyticky citlivá detekce proteinů na mikrotitračních destičkách ligací na blízkost se zesílením v kruhu“. Klinická chemie. 63 (9): 1497–1505. doi:10.1373 / clinchem.2017.271833. PMID  28667186.
  12. ^ Leuchowius KJ, Weibrecht I, Landegren U, Gedda L, Söderberg O (říjen 2009). „Flow cytometric in situ proximity ligační analýzy proteinových interakcí a posttranslační modifikace rodiny receptorů epidermálního růstového faktoru“. Cytometrie. Část A. 75 (10): 833–9. doi:10,1002 / cyto.a. 20771. PMID  19650109. S2CID  2550136.
  13. ^ Löf L, Arngården L, Olsson-Strömberg U, Siart B, Jansson M, Dahlin JS, et al. (Duben 2017). „Flow Cytometric Measurement of Blood Cells with BCR-ABL1 Fusion Protein in Chronic Myeloid Leukemia“. Vědecké zprávy. 7 (1): 623. Bibcode:2017NatSR ... 7..623L. doi:10.1038 / s41598-017-00755-r. PMC  5429594. PMID  28377570.
  14. ^ Liu Y, Gu J, Hagner-McWhirter A, Sathiyanarayanan P, Gullberg M, Söderberg O a kol. (Listopad 2011). „Western blotting via proximity ligation for high performance protein analysis“. Molekulární a buněčná proteomika. 10 (11): O111.011031. doi:10,1074 / mcp.O111.011031. PMC  3226413. PMID  21813417.