Blízké označení - Proximity labeling

Enzymově katalyzováno označení blízkosti (PL), také známý jako etiketování na základě blízkosti, je laboratorní technika že štítky biomolekuly, obvykle bílkoviny nebo RNA, proximálně k požadovanému proteinu.[1] Vytvořením genová fúze v živé buňce mezi sledovaným proteinem a vytvořeným značkovacím enzymem pak mohou být biomolekuly prostorově blízké sledovanému proteinu selektivně označeny biotin pro táhnout dolů a analýza. Pro identifikaci složek nových buněčných struktur a pro stanovení se použilo přibližovací značení interakce protein-protein partnery, mimo jiné aplikace.[2]
Dějiny
Před vývojem označení blízkosti se stanovení blízkosti bílkovin v buňkách spoléhalo na studium interakcí protein-protein pomocí metod, jako je afinitní čištění - hmotnostní spektrometrie a testy ligace blízkosti.[3]
DamID je metoda vyvinutá v roce 2000 společností Steven Henikoff pro identifikaci částí genomu proximálně k požadovanému proteinu chromatinu. DamID spoléhá na a DNA methyltransferáza fúze s proteinem chromatinu na nepřirozeně methylátovou DNA, která může být následně sekvenována, aby se odhalila místa methylace genomu poblíž proteinu.[4] Vědci se řídili strategií fúzních proteinů DamID, aby vytvořili metodu místně specifického značení proteinových cílů, což vyvrcholilo vytvořením BioID na bázi biotinového značení proteinů v roce 2012.[1] Alice Ting a laboratoř Ting v Stanfordská Univerzita zkonstruovali několik proteinů, které prokazují zlepšení účinnosti a rychlosti značení na bázi biotinu.[5][6][7][8]
Zásady
Blízké značení spoléhá na značkovací enzym, který může biotinylát blízké biomolekuly promiskuitně. Značení biotinu lze dosáhnout několika různými způsoby, v závislosti na druhu značení enzymu.
- BioID, také známý jako BirA *, je mutant E-coli biotin ligáza, která katalyzuje aktivace biotinu pomocí ATP. Aktivovaný biotin je krátkodobý, a proto může difundovat pouze do oblasti proximálně k BioID. Značení je dosaženo, když aktivovaný biotin reaguje s okolím aminy, tak jako lysin aminy sidechain nalezené v proteinech.[1] TurboID je biotin ligáza vytvořená pomocí kvasnicový povrchový displej řízená evoluce. TurboID umožňuje ~ 10minutové etiketovací časy namísto ~ 18hodinové etiketovací časy vyžadované BioID.[5]
- APEX je askorbátperoxidáza derivát závislý na peroxid vodíku pro katalýzu oxidace biotin-tyramidu, také známého jako biotin-fenol, na krátkodobý a reaktivní biotin-fenol volné radikály. Značení je dosaženo, když tento meziprodukt reaguje s různými funkčními skupinami blízkých biomolekul. APEX lze také použít k lokální depozici diaminobenzidinu, prekurzoru pro barvení elektronovou mikroskopií. APEX2 je derivát APEX vytvořený prostřednictvím evoluce řízené evolucí povrchu kvasinek. APEX2 vykazuje zlepšenou účinnost značení a úrovně buněčné exprese.[8]
Pro označení proteinů poblíž požadovaného proteinu začíná typický experiment označování blízkosti buněčná exprese fúze APEX2 se zájmovým proteinem, který se lokalizuje do přirozeného prostředí zájmového proteinu. Buňky se dále inkubují s biotin-fenolem, poté krátce s peroxidem vodíku, čímž se zahájí tvorba a značení volných radikálů biotin-fenolu. Aby se minimalizovalo poškození buněk, reakce se poté zastaví pomocí antioxidačního pufru. Buňky se lyžují a značené proteiny se stáhnou pomocí streptavidin korálky. Proteiny jsou tráveny trypsin a nakonec jsou výsledné peptidové fragmenty analyzovány pomocí brokovnice proteomika metody jako LC-MS / MS nebo SPS-MS3.[8]
Pokud místo toho fúze proteinu není geneticky přístupná (například ve vzorcích lidské tkáně), ale je známá protilátka pro požadovaný protein, může být blízké značení stále umožněno fúzí značkovacího enzymu s protilátkou a následnou inkubací fúze se vzorkem .[9][10]
Aplikace
Pro studium proteomů biologických struktur, které je jinak obtížné izolovat čistě a úplně, jako jsou například řasy,[11] mitochondrie,[6] postsynaptické rozštěpy,[2] p-těla, stresové granule,[12] a lipidové kapičky.[13]
Fúze APEX2 s Receptory spojené s G-proteinem (GPCRs) umožňuje jak sledování signalizace GPCR s časovým rozlišením 20 sekund[14] a také identifikace neznámých proteinů spojených s GPCR.[15]
Blízké označení bylo také použito pro transkriptomika a interaktomika. V roce 2019 Alice Ting a laboratoř Ting použili APEX k identifikaci RNA lokalizované do specifických buněčných kompartmentů.[16][17] V roce 2019 byl BioID upoután na beta-aktin přepis mRNA ke studiu jeho dynamiky lokalizace.[18] Blízké značení bylo také použito k nalezení interakčních partnerů heterodimerů proteinové fosfatázy, proteinu miRISC (komplex umlčování vyvolaný mikroRNA) Před 2 a ribonukleoproteiny.[3]
Nedávný vývoj
Pro identifikaci regulátorů receptoru zapojeného do vrozená imunitní odpověď, a NOD podobný receptor.[19] Pro identifikaci molekulárního složení bylo použito proximitní značení na bázi BioID rakovina prsu buňka invadopodia, které jsou důležité pro metastázy.[20] Studie označování blízkosti na základě biotinu ukazují zvýšené značení proteinů vnitřně neuspořádané oblasti, což naznačuje, že značení blízkosti biotinu lze použít ke studiu rolí IDR.[21] A fotosenzibilizátor byla vyvinuta také malá molekula zaměřená na jádro pro fotoaktivovatelné označení blízkosti.[22]
Reference
- ^ A b C Roux, Kyle J .; Kim, Dae In; Raida, Manfred; Burke, Brian (19. 3. 2012). „Promiskuitní fúzní protein biotin ligázy identifikuje proximální a interagující proteiny v savčích buňkách“. Journal of Cell Biology. 196 (6): 801–810. doi:10.1083 / jcb.201112098. ISSN 0021-9525. PMC 3308701. PMID 22412018.
- ^ A b Han, Shuo; Li, Jiefu; Ting, Alice Y (01.06.2018). „Blízkostní značení: prostorově rozlišené proteomické mapování pro neurobiologii“. Aktuální názor v neurobiologii. Neurotechnologie. 50: 17–23. doi:10.1016 / j.conb.2017.10.015. ISSN 0959-4388. PMC 6726430. PMID 29125959.
- ^ A b Trinkle-Mulcahy, Laura (2019-01-31). „Nedávný pokrok v metodách označování na základě blízkosti pro interaktomové mapování“. F1000Výzkum. 8: 135. doi:10.12688 / F1000Research.16903.1. ISSN 2046-1402. PMC 6357996. PMID 30774936.
- ^ Steensel, Bas van; Henikoff, Steven (duben 2000). "Identifikace in vivo cílů DNA proteinů chromatinu pomocí uvázané Dam methyltransferázy". Přírodní biotechnologie. 18 (4): 424–428. doi:10.1038/74487. ISSN 1546-1696.
- ^ A b Branon, Tess C .; Bosch, Justin A .; Sanchez, Ariana D .; Udeshi, Namrata D .; Svinkina, Tanya; Carr, Steven A .; Feldman, Jessica L .; Perrimon, Norbert; Ting, Alice Y. (2018-10-01). „Efektivní označování blízkosti v živých buňkách a organismech pomocí TurboID“. Přírodní biotechnologie. 36 (9): 880–887. doi:10,1038 / nbt.4201. ISSN 1546-1696. PMC 6126969. PMID 30125270.
- ^ A b Rhee, Hyun-Woo; Zou, Peng; Udeshi, Namrata D .; Martell, Jeffrey D .; Mootha, Vamsi K .; Carr, Steven A .; Ting, Alice Y. (2013-03-15). „Proteomické mapování mitochondrií v živých buňkách prostřednictvím prostorově omezeného enzymového značení“. Věda. 339 (6125): 1328–1331. Bibcode:2013Sci ... 339.1328R. doi:10.1126 / science.1230593. ISSN 0036-8075. PMC 3916822. PMID 23371551.
- ^ Lam, Stephanie S .; Martell, Jeffrey D .; Kamer, Kimberli J .; Deerinck, Thomas J .; Ellisman, Mark H .; Mootha, Vamsi K .; Ting, Alice Y. (leden 2015). „Cílený vývoj APEX2 pro elektronovou mikroskopii a označení blízkosti“. Přírodní metody. 12 (1): 51–54. doi:10.1038 / nmeth.3179. hdl:1721.1/110613. ISSN 1548-7105.
- ^ A b C Kalocsay, Marian (2019). „APEX peroxidázou katalyzované proximitní značení a multiplexovaná kvantitativní proteomika“. V Sunbul, Murat; Jäschke, Andres (eds.). Blízké označení. Proximity Labeling: Methods and Protocols. Metody v molekulární biologii. 2008. Springer. 41–55. doi:10.1007/978-1-4939-9537-0_4. ISBN 978-1-4939-9537-0. PMID 31124087.
- ^ Rees, Johanna S .; Li, Xue-Wen; Perrett, Sarah; Lilley, Kathryn S .; Jackson, Antony P. (01.11.2015). „Sousedové proteiny a blízká proteomika“. Molekulární a buněčná proteomika. 14 (11): 2848–2856. doi:10,1074 / mcp.R115,052902. ISSN 1535-9476. PMC 4638030. PMID 26355100.
- ^ Bar, Daniel Z; Atkatsh, Kathleen; Tavarez, Urraca; Erdos, Michael R; Gruenbaum, Yosef; Collins, Francis S (únor 2018). „Biotinylace rozpoznáváním protilátek - metoda označení blízkosti“. Přírodní metody. 15 (2): 127–133. doi:10.1038 / nmeth.4533. ISSN 1548-7091. PMC 5790613. PMID 29256494.
- ^ Mick, David U .; Rodrigues, Rachel B .; Leib, Ryan D .; Adams, Christopher M .; Chien, Allis S .; Gygi, Steven P .; Nachury, Maxence V. (2015-11-23). "Proteomika primárních řasinek podle označení blízkostí". Vývojová buňka. 35 (4): 497–512. doi:10.1016 / j.devcel.2015.10.015. ISSN 1878-1551. PMC 4662609. PMID 26585297.
- ^ Youn, Ji-Young; Dunham, Wade H .; Hong, Seo Jung; Knight, James D.R .; Bashkurov, Michail; Chen, Ginny I .; Bagci, Halil; Rathod, Bhavisha; MacLeod, Graham; Eng, Simon W.M .; Angers, Stéphane (únor 2018). „Mapování blízkosti s vysokou hustotou odhaluje subcelulární organizaci granulí a těl asociovaných s mRNA“. Molekulární buňka. 69 (3): 517–532.e11. doi:10.1016 / j.molcel.2017.12.020. ISSN 1097-2765. PMID 29395067.
- ^ Bersuker, Kirill; Peterson, Clark W. H .; Milton; Sahl, Steffen J .; Savikhin, Victoria; Grossman, Elizabeth A .; Nomura, Daniel K .; Olzmann, James A. (01.01.2018). „Strategie označování blízkosti poskytuje pohledy na složení a dynamiku proteinů kapiček lipidů“. Vývojová buňka. 44 (1): 97–112.e7. doi:10.1016 / j.devcel.2017.11.020. ISSN 1534-5807. PMID 29275994.
- ^ Paek, Jaeho; Kalocsay, Marian; Staus, Dean P .; Wingler, Laura; Pascolutti, Roberta; Paulo, Joao A .; Gygi, Steven P .; Kruse, Andrew C. (04 06, 2017). „Multidimenzionální sledování signalizace GPCR pomocí peroxidázou katalyzovaného přibližovacího značení“. Buňka. 169 (2): 338–349.e11. doi:10.1016 / j.cell.2017.03.028. ISSN 1097-4172. PMC 5514552. PMID 28388415. Zkontrolujte hodnoty data v:
| datum =
(Pomoc) - ^ Lobingier, Braden T .; Hüttenhain, Ruth; Eichel, Kelsie; Miller, Kenneth B .; Ting, Alice Y .; von Zastrow, Mark; Krogan, Nevan J. (04 06, 2017). „Přístup k časoprostorovému řešení sítí pro interakci proteinů v živých buňkách“. Buňka. 169 (2): 350–360.e12. doi:10.1016 / j.cell.2017.03.022. ISSN 1097-4172. PMC 5616215. PMID 28388416. Zkontrolujte hodnoty data v:
| datum =
(Pomoc) - ^ Shields, Emily J .; Petracovici, Ana F .; Bonasio, Roberto (2019-04-15). „lncRedibly univerzální: biochemické a biologické funkce dlouhých nekódujících RNA“. Biochemical Journal. 476 (7): 1083–1104. doi:10.1042 / BCJ20180440. ISSN 0264-6021. PMC 6745715. PMID 30971458.
- ^ Fazal, Furqan M .; Han, Shuo; Parker, Kevin R .; Kaewsapsak, Pornchai; Xu, Jin; Boettiger, Alistair N .; Chang, Howard Y .; Ting, Alice Y. (2019-07-11). "Atlas lokalizace subcelulární RNA odhalen APEX-Seq". Buňka. 178 (2): 473–490.e26. doi:10.1016 / j.cell.2019.05.027. ISSN 0092-8674. PMID 31230715.
- ^ Mukherjee, Joyita; Hermesh, Orit; Eliscovich, Carolina; Nalpas, Nicolas; Franz-Wachtel, Mirita; Maček, Boris; Jansen, Ralf-Peter (2019-06-25). „Mapování mRNA p-aktinu mRNA pomocí biotinylace blízkosti“. Sborník Národní akademie věd. 116 (26): 12863–12872. doi:10.1073 / pnas.1820737116. ISSN 0027-8424. PMID 31189591.
- ^ Zhang, Yongliang; Song, Gaoyuan; Lal, Neeraj K .; Nagalakshmi, Ugrappa; Li, Yuanyuan; Zheng, Wenjie; Huang, Pin-jui; Branon, Tess C .; Ting, Alice Y .; Walley, Justin W .; Dinesh-Kumar, Savithramma P. (2019-07-19). „Blízké značení založené na TurboID ukazuje, že UBR7 je regulátorem imunity zprostředkované imunitním receptorem N NLR“. Příroda komunikace. 10 (1): 1–17. doi:10.1038 / s41467-019-11202-z. ISSN 2041-1723.
- ^ Thuault, Sylvie; Mamelonet, Claire; Salameh, Joëlle; Ostacolo, Kevin; Chanez, Brice; Salaün, Danièle; Baudelet, Emilie; Audebert, Stéphane; Camoin, Luc; Badache, Ali (2020-04-22). „Proteomický přístup označující blízkost ke zkoumání molekulární krajiny invadopodií v buňkách rakoviny prsu“. Vědecké zprávy. 10 (1): 1–14. doi:10.1038 / s41598-020-63926-4. ISSN 2045-2322.
- ^ Minde, David-Paul; Ramakrishna, Manasa; Lilley, Kathryn S. (2020-01-22). „Biotin proximity tagging upřednostňuje rozvinuté proteiny a umožňuje studium vnitřně neuspořádaných oblastí“. Komunikační biologie. 3 (1): 1–13. doi:10.1038 / s42003-020-0758-r. ISSN 2399-3642.
- ^ Tamura, Tomonori; Takato, Mikiko; Shiono, Keiya; Hamachi, Itaru (05.12.2019). „Vývoj metody fotoaktivovatelné identifikace jaderných proteinů pomocí proximitního značení“. Chemické dopisy. 49 (2): 145–148. doi:10,1246 / cl.190804. ISSN 0366-7022.