Mikroskopická termoforéza - Microscale thermophoresis

Princip technologie MST: MST se provádí v tenkých kapilárách ve volném roztoku, čímž poskytuje téměř nativní podmínky (bez imobilizace v jakémkoli pufru, dokonce i ve složitých biokapalinách) a bezúdržbový nástroj. Při provádění experimentu MST je infračerveným laserem indukován mikroskopický teplotní gradient a jsou detekovány TRIC a termoforéza. TRIC závisí na mikroprostředí fluoroforu, které se obvykle mění ve vazebných událostech. Termoforéza, pohyb molekuly v teplotním gradientu, závisí na třech parametrech, které se obvykle mění při interakci. Celkový signál MST se tedy vynese proti koncentraci ligandu, aby se získala křivka závislosti odpovědi na dávce, ze které lze odvodit vazebnou afinitu.

Mikroskopická termoforéza (MST) je technologie pro biofyzikální analýza interakcí mezi biomolekuly. Microscale termoforéza je založen na detekci teplotně indukované změny fluorescence cíle jako funkce koncentrace nefluorescenčního ligandu. Pozorovaná změna fluorescence je založena na dvou odlišných účincích. Na jedné straně je založen na změně intenzity související s teplotou (TRIC) fluorescenční sondy, která může být ovlivněna vazebnými událostmi. Na druhé straně je založen na termoforéza, směrovaný pohyb částic mikroskopicky teplotní gradient. Jakákoli změna chemického mikroprostředí fluorescenční sondy, jakož i změny v hydratační skořápka Výsledkem biomolekul je relativní změna detekované fluorescence při použití teplotního gradientu a lze ji použít ke stanovení vazebné afinity. MST umožňuje měření interakcí přímo v roztoku bez nutnosti imobilizace na povrch (technologie bez imobilizace).

Aplikace

Afinita

Stechiometrie

Termodynamické parametry

MST byl použit k odhadu entalpický a entropický příspěvky k biomolekulárním interakcím.[10]

Dodatečné informace

  • Vlastnost vzorku (homogenita, agregace, stabilita)
  • Více vazebných míst, kooperativnost

Technologie

MST je založen na kvantifikovatelné detekci změny fluorescence ve vzorku, když se použije změna teploty. Fluorescence cílové molekuly může být vnější nebo vnitřní (aromatická aminokyseliny ) a je změněn v teplotních gradientech kvůli dvěma odlišným účinkům. Na jedné straně změna intenzity související s teplotou (TRIC), která popisuje vnitřní vlastnost fluorofory měnit jejich intenzitu fluorescence jako funkci teploty. Rozsah změny intenzity fluorescence je ovlivněn chemickým prostředím fluorescenční sondy, které může být změněno ve vazebných událostech v důsledku konformační změny nebo blízkost ligandy.[11][12] Na druhou stranu je MST také založen na řízeném pohybu molekul podél teplotních gradientů, což je účinek nazývaný termoforéza. Prostorový teplotní rozdíl ΔT vede ke změně koncentrace molekul v oblasti zvýšené teploty, kvantifikované Soretovým koeficientem ST:Chorký/CStudený = exp (-ST ΔT).[13][14] Jak TRIC, tak termoforéza přispívají k zaznamenávanému signálu v měřeních MST následujícím způsobem: ∂ / ∂T (cF) = c∂F / ∂T + F∂c / ∂T. První člen v této rovnici c∂F / ∂T popisuje TRIC jako změnu intenzity fluorescence (F) jako funkci teploty (T), zatímco druhý člen F∂c / ∂T popisuje termoforézu jako změnu koncentrace částic c) jako funkce teploty. Termoforéza závisí na rozhraní mezi molekulou a rozpouštědlem. Za podmínek konstantního pufru sonduje termoforéza velikost, náboj a solpační entropii molekul. Termoforéza fluorescenčně značené molekuly A se typicky významně liší od termoforézy komplexu molekula-cíl AT kvůli rozdílům ve velikosti, náboji a solpační entropii. Tento rozdíl v termoforéze molekuly se používá ke kvantifikaci vazby v titračních experimentech za podmínek konstantního pufru.

Termoforetický pohyb fluorescenčně značené molekuly se měří monitorováním fluorescence distribuce F uvnitř kapiláry. Mikroskopický teplotní gradient je generován infračerveným laserem, který je zaostřen do kapiláry a je silně absorbován vodou. Teplota vodného roztoku v laserové skvrně se zvýší o ΔT = 1-10 K. Před zapnutím IR-laseru se homogenní distribuce fluorescence FStudený je pozorován uvnitř kapiláry. Když je IR laser zapnutý, vyskytují se dva efekty ve stejném časovém měřítku, což přispívá k novému rozdělení fluorescence Fhorký. Tepelná relaxace indukuje vazebně závislý pokles fluorescence barviva v důsledku jeho lokální reakce závislé na prostředí na teplotní skok (TRIC). Současně se molekuly obvykle pohybují z místně zahřáté oblasti do vnějších chladných oblastí. Místní koncentrace molekul ve vyhřívané oblasti klesá, dokud nedosáhne distribuce v ustáleném stavu.

Zatímco hmota difúze D určuje kinetiku vyčerpání, ST určuje poměr koncentrace v ustáleném stavu chorký/CStudený= exp (-ST ΔT) ≈ 1-ST ΔT při zvýšení teploty ΔT. Normalizovaná fluorescence Fnorma= Fhorký/FStudený měří hlavně tento koncentrační poměr, navíc k TRIC ∂F / ∂T. V lineární aproximaci najdeme: Fnorma= 1 + (∂F / ∂T-ST) ΔT. Díky linearitě intenzity fluorescence a termoforetickému vyčerpání byla normalizovaná fluorescence z nenavázané molekuly Fnorma(A) a vázaný komplex Fnorma(AT) superponovat lineárně. Označením x zlomku molekul navázaných na cíle je měnící se fluorescenční signál během titrace cíle T dán vztahem: Fnorma= (1-x) Fnorma(A) + x F.norma(NA).[11]

Kvantitativní parametry vazby se získají použitím sériového ředění vazebného substrátu. Vynesením Fnorma proti logaritmu různých koncentrací řady ředění se získá křivka sigmoidální vazby. Tuto vazebnou křivku lze přímo vybavit nelineárním řešením zákon hromadné akce, s disociační konstantou K.D jako výsledek.[15][16][17]

Reference

  1. ^ Asmari M, Ratih R, Alhazmi HA, El Deeb S (únor 2018). „Termoforéza pro charakterizaci biomolekulární interakce“ (PDF). Metody. 146: 107–119. doi:10.1016 / j.ymeth.2018.02.003. PMID  29438829.
  2. ^ Mueller AM, Breitsprecher D, Duhr S, Baaske P, Schubert T, Längst G (2017). „Mikro Měřítko Termoforéza: Rychlá a přesná metoda kvantifikace interakcí protein – nukleová kyselina v roztoku “. MicroScale Thermoforesis: a Rapid and Precise Method to Quantify Protein-Nucleic Acid Interactions in Solution. Metody v molekulární biologii. 1654. str. 151–164. doi:10.1007/978-1-4939-7231-9_10. ISBN  978-1-4939-7230-2. PMID  28986788.
  3. ^ Filarsky M, Zillner K, Araya I, Villar-Garea A, Merkl R, Längst G, Németh A (2015). „Rozšířený AT-hák je nový motiv vázání RNA“. RNA Biology. 12 (8): 864–76. doi:10.1080/15476286.2015.1060394. PMC  4615771. PMID  26156556.
  4. ^ A b Seidel SA, Dijkman PM, Lea WA, van den Bogaart G, Jerabek-Willemsen M, Lazic A a kol. (2013). „Termoforéza v mikroskopickém měřítku kvantifikuje biomolekulární interakce za dříve náročných podmínek“. Metody. 59 (3): 301–15. doi:10.1016 / j.ymeth.2012.12.005. PMC  3644557. PMID  23270813.
  5. ^ Seidel SA, Wienken CJ, Geissler S, Jerabek-Willemsen M, Duhr S, Reiter A, Trauner D, Braun D, ​​Baaske P (2012). „Termoforéza v mikroskopickém měřítku bez označení rozlišuje místa a afinitu vazby protein-ligand“. Angew. Chem. Int. Vyd. Engl. 51 (42): 10656–9. doi:10,1002 / anie.201204268. PMC  3588113. PMID  23001866.
  6. ^ Linke P, Amaning K, Maschberger M, Vallee F, Steier V, Baaske P, Duhr S, Breitsprecher D, Rak A (duben 2016). „Přístup k automatizované mikroskopické termoforéze pro zjišťování olova na základě fragmentů“. Journal of Biomolecular Screening. 21 (4): 414–21. doi:10.1177/1087057115618347. PMC  4800460. PMID  26637553.
  7. ^ Jerabek-Willemsen M, Wienken CJ, Braun D, ​​Baaske P, Duhr S (srpen 2011). „Molekulární interakční studie využívající mikroskopickou termoforézu“. Technologie pro testování a vývoj léčiv. 9 (4): 342–53. doi:10.1089 / adt.2011.0380. PMC  3148787. PMID  21812660.
  8. ^ Dijkman PM, Watts A (listopad 2015). „Lipidová modulace časných signálních událostí receptoru spřažených s G proteinem“. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembrány. 1848 (11 Pt A): 2889–97. doi:10.1016 / j.bbamem.2015.08.004. PMID  26275588.
  9. ^ Vilanova O, Mittag JJ, Kelly PM, Milani S, Dawson KA, Rädler JO, Franzese G (prosinec 2016). „Pochopení kinetiky tvorby proteinu a nanočástic Corona“. ACS Nano. 10 (12): 10842–10850. doi:10.1021 / acsnano.6b04858. PMC  5391497. PMID  28024351.
  10. ^ Jerabek-Willemsen M, André T, Wanner A, Roth HM, Duhr S, Baaske P, Breitsprecher D (2014). „MicroScale Thermoforesis: Interaction analysis and beyond“. Journal of Molecular Structure. 1077: 101–113. Bibcode:2014JMoSt1077..101J. doi:10.1016 / j.molstruc.2014.03.009.
  11. ^ A b Baaske P, Wienken CJ, Reineck P, Duhr S, Braun D (2010). "Optická termoforéza pro kvantifikaci závislosti pufru na vazbě aptameru na pufr". Angew. Chem. Int. Vyd. Engl. 49 (12): 1–5. doi:10.1002 / anie.200903998. PMID  20186894. Shrnutí ležel – Phsyorg.com.
  12. ^ Gupta AJ, Duhr S, Baaske P (2018). Mikroskopická termoforéza (MST). Encyklopedie biofyziky. s. 1–5. doi:10.1007/978-3-642-35943-9_10063-1. ISBN  9783642359439.
  13. ^ Duhr S, Braun D (2006). „Proč se molekuly pohybují podél teplotního gradientu“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (52): 19678–82. Bibcode:2006PNAS..10319678D. doi:10.1073 / pnas.0603873103. PMC  1750914. PMID  17164337.
  14. ^ Reineck P, Wienken CJ, Braun D (2010). "Termoforéza jednovláknové DNA". Elektroforéza. 31 (2): 279–86. doi:10.1002 / elps.200900505. PMID  20084627. S2CID  36614196.
  15. ^ Wienken CJ, Baaske P, Rothbauer U, Braun D, ​​Duhr S (2010). „Proteinové vazebné testy v biologických kapalinách pomocí mikroskopické termoforézy“. Nat Commun. 1 (7): 100. Bibcode:2010NatCo ... 1..100W. doi:10.1038 / ncomms1093. PMID  20981028.
  16. ^ Baaske P, Wienken C, Duhr S (2009). „Optisch erzeugte Thermophorese für die Bioanalytik“ [Opticky generovaná termoforéza pro bioanalýzu] (PDF). Biofotonik (v němčině): 22–24.[mrtvý odkaz ]
  17. ^ Wienken CJ, Baaske P, Duhr S, Braun D (2011). „Termoforetické křivky tání kvantifikují konformaci a stabilitu RNA a DNA“. Nucleic Acids Res. 39 (8): e52. doi:10.1093 / nar / gkr035. PMC  3082908. PMID  21297115.