Affimer - Affimer

Affimer proteinové lešení - ukazující dvě smyčky a amino-konec, kde mohou být vloženy návrhářské nebo náhodné peptidy pro vytvoření cílového specifického vazebného povrchu

Affimerové molekuly^[1] jsou malé bílkoviny které se vážou na cílové molekuly s podobnou specificitou a afinitou jako protilátky.^[2][3] Tyto upravené proteiny nevázající protilátky jsou navrženy pro napodobit charakteristiky molekulárního rozpoznávání monoklonální protilátky v různých aplikacích.^[2][4] Navíc tyto afinitní činidla byly optimalizovány pro zvýšení jejich stability,^[5] aby byly tolerantní k různým teplotám a pH,^[6] zmenšit jejich velikost a zvýšit jejich výraz v E-coli a savčí buňky.^[2]

Rozvoj

Affimer proteiny byly původně vyvinuty na MRC rakovinová buněčná jednotka v Cambridge a poté ve dvou laboratořích v University of Leeds.^{[7][8][9][10]} Odvozeno z cysteinová proteáza rodina inhibitorů cystatiny, které v přírodě fungují jako inhibitory cysteinové proteázy,^[11][12] těchto 12–14 kDa proteiny sdílejí společnou terciární strukturu alfa-šroubovice ležící na antiparalele beta-list.^[13]

Affimerové proteiny vykazují dvě peptidové smyčky a N-koncovou sekvenci, kterou lze všechny náhodně vázat na požadované cílové proteiny s vysokou afinitou a specificitou,^[5] podobným způsobem jako monoklonální protilátky. Stabilizace dvou peptidů proteinovým skeletem omezuje možné konformace, které mohou peptidy přijímat, což zvyšuje vazebnou afinitu a specificitu ve srovnání s knihovnami volných peptidů.

Výroba

Fágový displej knihovny 10¹⁰ randomizované potenciální cílové interakční sekvence^[14] se používají k screeningu Affimer proteinů, které vykazují vysokou specificitu vazby na cílový protein s vazebnými afinitami v nM rozsah.^[5][15][16] Schopnost řídit in vitro screeningové techniky umožňují identifikaci vysoce specifických, vysoce afinitních Affimerových pojiv, negujících požadavky na afinitní zrání těchto činidel. In vitro screening a vývoj také znamenají, že cílový prostor pro Affimer pojiva není omezen hostitelem zvířete imunitní systém. Vzhledem k tomu, že proteiny Affimer jsou generovány pomocí rekombinantních systémů, je jejich tvorba výrazně rychlejší a reprodukovatelnější ve srovnání s produkcí tradičních protilátky.^[17]

Byly generovány multimerní formy affimerových proteinů a bylo prokázáno, že poskytují titrimetrické objemy v rozmezí 200–400 mg / l při kultivaci v malém měřítku za použití bakteriálních hostitelských systémů. Poskytnuty multimerní formy affimerových proteinů se stejnou cílovou specificitou avidita účinky ve vazbě na cíl, zatímco fúze různých Affimerových proteinů s různými cílovými specificitami by umožnila multi-specifické afinitní proteiny.^[18]

Mnoho různých značek a fúzních proteinů, jako je fluorofory, jednořetězcová DNA, jeho a c-Myc tagy lze snadno konjugovat na Affimer proteiny.^{[2][19][20][21][22][23]} Specifické cysteinové zbytky mohou být zavedeny do proteinu, aby chemie thiolu rovnoměrně orientovala proteiny Affimeru na pevný podklad za účelem zvýšení zachycení cíle v testech vazby ligandů a biosenzorech.^{[5][15][17][24][25]} Tato flexibilní funkcionalizace molekuly Affimer maximalizuje výkon reagens Affimer napříč různými aplikacemi a formáty testu.

Vlastnosti

Affimerová pojiva jsou rekombinantní proteiny. Vykazují robustní vlastnosti vysoké termostability s teplotami tání nad 80 ° C,^[10] odolnost vůči extrémům pH (2–13,7),^[10] cykly zmrazení-rozmrazení a lyofilizace. Nízká molekulová hmotnost Affimerových pojiv znamená, že je možné se vyhnout problémům se sterickou zábranou, které jsou typicky pozorovány u protilátek.^[2] Protože jsou vyráběny pomocí rekombinantních bakteriálních výrobních postupů, je u Affimerových činidel udržována konzistence mezi šaržemi, čímž se překonávají některé problémy reprodukovatelnosti a bezpečnosti dodávek.^{[2][3][17][26][27]}

Tyto syntetické protilátky byly navrženy tak, aby byly stabilní, netoxické, biologicky neutrální a neobsahovaly žádné posttranslační úpravy nebo disulfidové můstky.^[7][8][10] Dvě oddělené smyčkové sekvence, které obsahují celkem 12 až 36 aminokyselin, tvoří povrch cílové interakce, takže povrchy interakce se mohou pohybovat v rozmezí 650–1000A. Má se za to, že velký povrch interakce vede k vysoce specifické, vysoce afinitní vazbě na cílové proteiny.^{[5][7][10][15][17][19][28][29][30][31]} Ve výsledku mohou molekuly Affimer rozlišovat mezi proteiny, které se liší pouze jedním aminokyselina, dokáže detekovat jemné změny v úrovních exprese proteinu i v a multiplexovaný formátu a dokáže rozlišovat mezi několika úzce souvisejícími proteinové domény.^{[2][24][31][32][33]}

Aplikace

Technologie Affimer byla komercializována a vyvinuta společností Avacta, která vyvíjí tato afinitní činidla jako nástroje pro výzkum a diagnostiku a jako bioterapeutika.

Činidla a diagnostika

Affimer pojiva byla použita na celé řadě platforem, včetně ELISA,^[2][17][34] povrchová plazmonová rezonance,^{[32][34][35][36]} afinitní čištění,^[2][34][37] imunohistochemie^[2] a imunocytochemie, počítaje v to zobrazování v super rozlišení.^{[2][19][20][21]} Affimerová činidla, která inhibují interakce protein-protein mohou být také produkovány s potenciálem exprimovat tyto inhibitory v savčích buňkách za účelem zkoumání a modifikace signálních drah.^{[2][32][35][38][39]} Byly také kokrystalizovány v komplexu s cílovými proteiny,^[32][35][40] umožnění objevování drog prostřednictvím in silico screeningové a vytěsňovací testy.^[14]

Affimerova činidla jsou vhodná pro použití v biosenzorech,^{[5][15][24][25]} diagnostika v místě péče a jako antiidiotypová činidla ve farmakokinetických a terapeutických monitorovacích testech léčiv.^{[26][27][31][41][42]}

Terapeutika

Affimer proteinové lešení bylo vyvinuto jako bioterapeutické. Malá velikost a profil stability proteinů Affimer v kombinaci s jejich lidským původem propůjčují molekulám Affimer molekuly podobné vlastnosti. To může představovat výhody oproti protilátky pokud jde o penetraci tkáně, například v pevné látce nádory nebo neinvazivní lokální administrace, jako je inhalační podání nebo dermální aplikace.^[18]

Affimerové proteiny mohou být snadno konjugovány za vzniku multimerů a mohou být snadno funkcionalizovány pro návrh terapeutik se specifickými požadovanými vlastnostmi. Mezi příklady patří produkce multi-specifických Affimerových molekul k cílení a náboru konkrétních buněk, fúze k Fc fragmenty nebo albumin pořadače vyladit jejich poločas rozpadu in vivo a pro použití jako zacilující skupina v chimérických receptorech nebo modifikovaná tak, aby nesla toxin v konjugátech Affimer-lék.^[16][18][43]

Affimer Therapeutics jsou v objevu a preklinickém vývoji, který je třeba řešit poruchy srážení krve, odolnost proti antibiotikům, fenotypové modely objevování léků a rakovina, přes VOZÍK buněčná terapie a podobně inhibitory imunitního kontrolního bodu.^{[18][44][45][46]} Rané studie s využitím ex vivo lidské vzorky vykazovaly nízkou hladinu imunogenicita spojené s Affimerovým skeletem, na úrovních srovnatelných s prodávaným terapeutickým přípravkem na protilátky.^[47] Počáteční preklinické studie dále prokázaly dobrou účinnost a snášenlivostPDL1 imunoonkologický Affimer terapeutický u myší. Předpokládá se, že podání IND pro první terapeutický přípravek Affimer proběhne v letech 2019/2020.^[16]

Reference

externí odkazy

• Avacta
• Úvod do technologie Affimer - video