NanoCLAMP - nanoCLAMP - Wikipedia

V lékařské oblasti imunologie, nanoCLAMP (CLostridal Antibody Mimetický Proteiny) afinitní činidla jsou rekombinantní 15 kD protilátkové mimetikum proteiny vybrané pro těsnou, selektivní a jemně reverzibilní vazbu na cílové molekuly.[1] Lešení nanoCLAMP je založeno na termostabilní jako IgG skupina modulů vázajících sacharidy 32 (CBM32) od a Clostridium perfringens hyaluronidáza (Mu toxin). Tvar nanoCLAMPů se blíží válci o délce přibližně 4 nm a průměru 2,5 nm, zhruba stejné velikosti jako nanobody (PDB: 2W1Q). nanoCLAMPs ke konkrétním cílům jsou generovány změnou aminokyselina sekvence a někdy i délka tří vystavených rozpouštědlům, sousedních smyček, které spojují beta řetězce tvořící beta-sendvičový záhyb, udělující vazebnou afinitu a specificitu pro cíl.[1]

Vlastnosti

nanoCLAMPs jsou první protilátková mimetika popsáno jako polyol - reagovat,[2] což znamená, že uvolní své cíle po vystaveníchaotropní sůl a polyol, jako propylenglykol.[1][3] Ukázalo se, že tato vlastnost je užitečná pro čištění funkčních proteinů a proteinové komplexy podle afinitní čištění. nanoCLAMPs se snadno vyrábějí v cytoplazma z E-coli, s typickými výtěžky v rozmezí 50 až 300 mg / l kultury. Protože nanoCLAMPs postrádají cysteiny, může být vytvořen C-terminální cystein použit pro místně řízenou konjugaci entit jako fluorofory nebo pryskyřice pomocí thiol -chemie.

Vývoj a aplikace

nanoCLAMP byly vyvinuty v laboratořích společnosti Nectagen, Inc. nanoCLAMP fágový displej byly zkonstruovány knihovny, které variabilizovaly 16 exponovaných povrchů aminokyseliny ve třech smyčkách s různorodostí funkcí přibližně 109 varianty. U těchto knihoven byla prověřena vazba na cíl bílkoviny a peptidy, obvykle poskytující 1 až 30 jedinečných pojiv k cíli.[1]

Vyčištěné nanoCLAMPy obsahující jeden C-koncový cystein lze snadno konjugovat s halo-acetylovou aktivací agaróza pryskyřice za nativních nebo denaturačních podmínek a výsledné thioether vazba činí pryskyřice odolné proti průniku. Cíle lze vyčistit do zjevné homeogenity v jednom kroku. The polyol - reagovat[2] povaha pryskyřic umožňuje, aby byly cíle vymýt s 0,75 M síran amonný a 40% propylenglykol na pH 7.9, podmínky, u nichž bylo prokázáno, že zachovávají přirozenou strukturu a proteinové komplexy.[1][3][4][5][6]

nanoCLAMPs byly vyrobeny tento cíl zelený fluorescenční protein (GFP), mCherry, SUMO (SMT3), NusA, avidin, NeutrAvidin, protein vázající maltózu (MBP), thioredoxin 1, beta-galaktosidáza, SlyD a další. Typické vazebné kapacity pryskyřic se pohybují od 1 do 4 mg / ml pryskyřice. Vzhledem k tomu, že nanoCLAMP se snadno znovu skládají, lze pryskyřice nanoCLAMP regenerovat vícekrát pomocí guanidiniumchlorid k vyčištění pryskyřice.[1]

Reference

  1. ^ A b C d E F Suderman RJ, Rice DA, Gibson SD, Strick EJ, Chao DM (17. dubna 2017). „Vývoj polyolových protilátkových mimetik pro jednokrokové čištění proteinů“. Exprese a čištění proteinů. 134: 114–124. doi:10.1016 / j.pep.2017.04.008. PMID  28428153.
  2. ^ A b Burgess RR, Watson JD (červen 2017). "Jemná protilátka-mimetická afinitní chromatografie s nanoCLAMPy reagujícími na polyoly". Exprese a čištění proteinů. 134: 154–155. doi:10.1016 / j.pep.2017.06.002.
  3. ^ A b Thompson NE, Aronson DB, Burgess RR (1990). „Čištění eukaryotické RNA polymerázy II imunoafinitní chromatografií. Eluce aktivního enzymu činidly stabilizujícími proteiny z monoklonální protilátky reagující na polyol“. J Biol Chem. 265: 7069–7077. PMID  2324114.
  4. ^ Thompson NE, Foley KM, Stalder ES, Burgess, RR (2009). "Identifikace, produkce a použití polyol-reagujících monoklonálních protilátek pro imunoafinitní chromatografii". Metody Enzymol. 463: 475–494. doi:10.1016 / S0076-6879 (09) 63028-7. PMID  19892188.
  5. ^ Thompson NE, Hager DA, Burgess RR (4. srpna 1992). "Izolace a charakterizace polyol-reagující monoklonální protilátky užitečné pro jemné čištění RNA polymerázy Escherichia coli". Biochemie. 31: 7003–7008. doi:10.1021 / bi00145a019. PMID  1637835.
  6. ^ Thompson NE, Jensen DB, Lamberski JA, Burgess RR (2006). "Čištění proteinových komplexů imunoafinitní chromatografií: aplikace na transkripční aparát". Genet Eng (N Y). 27: 81–100. PMID  16382873.

externí odkazy