Affitin - Affitin

Divoký typ Sac7d (modrá a oranžová) zalomení DNA (šeřík), z PDB: 1AZP​

Affitiny[1][2] (obchodní název Nanofitiny) jsou umělé bílkoviny se schopností selektivně vázat antigeny. Jsou strukturálně odvozeny z DNA vazebný protein Sac7d, nalezen v Sulfolobus acidocaldarius, mikroorganismus patřící do archaeal doména. Náhodou aminokyseliny na vazebném povrchu Sac7d a výsledná proteinová knihovna byla podrobena cyklům ribozomový displej, afinita může být směrována k různým cílům, jako je např peptidy, bílkoviny, viry a bakterie.[3][4] Affitiny jsou protilátková mimetika a jsou vyvíjeny jako alternativa k protilátky jako nástroje v biotechnologie. Rovněž se používají jako specifické inhibitory různých enzymů.[Citace je zapotřebí ] Affitiny lze použít v biochemických technikách čištění, konkrétně v afinitní chromatografii. Schopnost affitinů selektivně vázat antigeny se používá k cílení na specifické proteiny. Vědci dokázali očistit člověka imunoglobulin G. (hIgG), bakteriální protein PulD a lysozym z kuřecího vejce s použitím Affitinových kolon s vysokým stupněm čistoty.[5] Ty mají schopnost působit jako specifické ligandy pro zájmové proteiny, které jsou potřebné, když je fúze proteinů s polypeptidovými značkami nemožná nebo nepřináší žádnou výhodu, a tak vytvářejí afinitní kolony, jako je tomu v případě výroby biofarmaceutik. Byli imobilizováni na agaróza matrice a sloupce měly vysoký stupeň selektivity. Kromě toho mohou být protilátky a neimunoglobinové proteiny čištěny pomocí afitinů pomocí afinitní chromatografie.[6] Díky své malé velikosti a vysoké rozpustnosti je lze snadno vyrobit ve velkých množstvích pomocí bakteriálních expresních systémů.

Vlastnosti

Affitiny se skládají ze 66 aminokyselin a mají a molekulová hmotnost asi 7kDa, malé ve srovnání s protilátkami s přibližně 130–150 kDa. Získáváno od a termofilní organismus, jsou to neobvykle žáruvzdorné proteiny. Affitiny jsou navíc trvanlivé - jsou schopné vydržet mnoho cyklů čištění.[Citace je zapotřebí ] Na rozdíl od protilátek se produkují afitiny in vitro, a proto je lze generovat rychleji.[3] Díky své malé velikosti a vysoké rozpustnosti je lze snadno vyrobit ve velkých množstvích pomocí bakteriálních expresních systémů.

Affitiny jsou silně modifikovaná činidla, která jsou extremofilní, protože se nacházejí v Archae, jako je Sac7d, což je hypertermní protein. Jsou to uměle vázající proteiny s vysokou afinitou, malou velikostí a nízkou strukturní složitostí. Mají dva různé způsoby vazby. Jeden vyžaduje pouze rovný povrch, zatímco druhý způsob vazby vyžaduje rovný povrch a dvě krátké smyčky. Jsou to tepelně a chemicky stabilní činidla a jejich stabilita může být dále zvýšena použitím mutačních nebo roubovacích technik. Další způsoby jejich stabilizace zahrnují použití sekvenčních prvků z jiných proteinů, které patří do stejné rodiny, přepínání vazebného povrchu, a tedy mají delší vazebné kapacity. To bylo provedeno naroubováním vazebného povrchu D1Sac7d na Sso7d, který je stabilnější, a zavedením bodových mutací dříve identifikovaných jako stabilizující pro WT Sso7d.[7]

Stručně řečeno, Affitiny jsou ideální reagenty pro afinitní chromatografii, protože jsou trvanlivé, vysoce selektivní, nákladově efektivní, odolné vůči extrémnímu alkalickému pH a chemicky a tepelně stabilní. Hrají také významnou roli v biotechnologických a klinických aplikacích. Použití affitinu poskytuje důležité a užitečné metody pro in vivo a in vitro analýzu proteinové struktury.

Reference

  1. ^ Correa, A; Pacheco, S; Mechaly, A.E .; Obal, G; Béhar, G; Mouratou, B; Oppezzo, P; Alzari, P. M .; Pecorari, F (2014). "Silná a specifická inhibice glykosidáz malými umělými vazebnými proteiny (afitiny)". PLOS ONE. 9 (5): e97438. Bibcode:2014PLoSO ... 997438C. doi:10.1371 / journal.pone.0097438. PMC  4019568. PMID  24823716.
  2. ^ Pacheco, S; Béhar, G; Maillasson, M; Mouratou, B; Pecorari, F (2014). „Přenos afinity k archaeálnímu extremofilnímu proteinu Sac7d vložením CDR“. Návrh a výběr proteinového inženýrství. 27 (10): 431–8. doi:10.1093 / protein / gzu042. PMID  25301962.
  3. ^ A b Mouratou, B; Schaeffer, F; Guilvout, já; Tello-Manigne, D; Pugsley, AP; Alzari, PM; Pecorari, F (2007). „Remodelace DNA vázajícího proteinu jako specifického in vivo inhibitoru bakteriálního sekretinu PulD“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 104 (46): 17983–8. Bibcode:2007PNAS..10417983M. doi:10.1073 / pnas.0702963104. PMC  2084283. PMID  17984049.
  4. ^ Krehenbrink, M; Chami, M; Guilvout, já; Alzari, PM; Pécorari, F; Pugsley, AP (2008). "Umělé vazebné proteiny (affitiny) jako sondy pro konformační změny v sekretinu PulD". Journal of Molecular Biology. 383 (5): 1058–68. doi:10.1016 / j.jmb.2008.09.016. PMID  18822295.
  5. ^ Béhar, Ghislaine; Renodon-Cornière, Axelle; Mouratou, Barbara; Pecorari, Frédéric (2016). „Affitiny jako robustní reagenty šité na míru pro afinitní chromatografickou purifikaci protilátek a neimunoglobulinových proteinů“. Journal of Chromatography A. 1441: 44–51. doi:10.1016 / j.chroma.2016.02.068. PMID  26952369.
  6. ^ Béhar, G., Renodon-Cornière, A., Mouratou, B., & Pecorari, F. (2016). Affitiny jako robustní reagenty šité na míru pro afinitní chromatografickou purifikaci protilátek a neimunoglobulinových proteinů. Journal of Chromatography A, 1441, 44-51.
  7. ^ Béhar, G., Pacheco, S., Maillasson, M., Mouratou, B., & Pecorari, F. (2014). Přepínání vazebného místa anti-IgG mezi archaeálními extremofilními proteiny vede k afitinům se zvýšenou stabilitou pH. Journal of Biotechnology, 192, 123-129.