Oplophorus-luciferin 2-monooxygenáza - Oplophorus-luciferin 2-monooxygenase - Wikipedia

v enzymologie, an Oplophorus-luciferin 2-monooxygenáza (ES 1.13.12.13 ), také známý jako Oplophorus luciferáza (v tomto článku označován jako OpLuc) je a luciferáza, an enzym, z hlubin krevety Oplophorus gracilirostris [2] patřící do skupiny coelenterazinových luciferáz. Na rozdíl od jiných luciferáz má širší substrátovou specificitu [3,4,6] a může se také efektivně vázat na bisdeoxycoelenterazin [3,4]. Je to třetí příklad luciferázy (jiné než Aequorea a Renilla) k čištění v laboratoři [2]. The systematické jméno této třídy enzymů je Oplophorus-luciferin: kyslík-2-oxidoreduktáza (dekarboxylační). Tento enzym se také nazývá Oplophorus luciferáza.

Chemická reakce

Dva substráty tohoto enzymu jsou luciferin, Coelenterazin a Ó₂ a jeho 3 produkty jsou oxyluciferin, Coelenteramid, CO₂, a světlo.Tento enzym patří do rodiny oxidoreduktázy, zejména těch, kteří jednají s jedinými dárci s O₂ jako oxidant a inkorporace dvou atomů kyslíku do substrátu (oxygenázy). Inkorporovaný kyslík nemusí být odvozen od O inkorporací jednoho atomu kyslíku (vnitřní monooxygenázy nebo vnitřní oxidázy se smíšenou funkcí). I když je enzym součástí skupiny enzymů, které působí na coelenterazin, jako je např Renilla a Gaussia luciferázy, nesdílí sekvence párů bází s těmito enzymy [3,4,5,7].

OpLuc katalyzuje nezávislý na ATP chemická reakce [3,4,5,6]:

coelenterazin (Oplophorus luciferin) + O.₂ ${ displaystyle rightarrow}$ coelenteramid + CO₂ + hν

Výsledkem tohoto procesu je určitá ztráta CO2 a foton modrého světla emitovaného při ~ 460 nm [2,3,4]. Tato reakce má optimální pH 9, optimální koncentraci soli 0,05-0,1 M a optimální teplotu ~ 40 C (což z ní činí neobvykle tepelně odolnou luciferázu) [2], i když proto O. gracilirostris jsou hlubinní živočichové žijící při teplotách pod 20 ° C, luciferáza se běžně exprimuje a skládá při nízkých teplotách [6].

Biologická funkce

Při stimulaci Oplophorus gracilirostris, OpLuc je vylučován ze základny nohou a antén hlubinných krevet jako obranný mechanismus. Tento mechanismus způsobuje O. gracilirostris uvolnit světelný, jasně modrý oblak luciferázy [2].

Oplophorus gracilirostris

Enzym Pathway

Malá proteinová podjednotka OpLuc, 19 kda, má aminoterminální peptidovou sekvenci, která při stimulaci signalizuje, že se enzym váže na coelenterazin, Oplophorus luciferin (substrát) [3,7]. Zobrazeno v Obrázek 1, enzym poté oxiduje coelenterazin ve vodném médiu na luminiscenční produkt, coelenteramid, a uvolňuje CO2 jako vedlejší produkt [2,3,7].

Struktura

OpLuc je komplex dvou kovalentně vázaných [3] proteinových podjednotek: dvou molekul 19 kDa a dvou molekul složek 35 kDa, což z něj činí heterotetramerickou molekulu. Proteiny signalizují sekreci enzymu v luminiscenci, katalyzovanou proteinem 19 kDa [3,4,7]. Luciferáza má mnoho cysteinových zbytků, které stabilizují enzym v extracelulárním prostředí pomocí disulfidových vazeb [5].

Protein 19 kDa

Tato katalytická složka OpLuc má 196 aminokyselin [3] s jedním cysteinem na karboxylovém konci a je odlišná od proteinů nalezených v jiných luciferázách [4]. Protein je tvořen dvěma doménami s opakovaným sekvenováním Ia-c a Ila-d v peptidovém řetězci [4]. Předpokládá se, že je to protein, který způsobuje bioluminiscenční reakci O. gracilirostris, ale funguje neúčinně bez svého většího protějšku podjednotky [3,4]. Přestože krystalová struktura OpLec ještě musí být úplně analyzována a zmapována, 19 kDa experimentálně exprimovalo v savčích buňkách (považováno za KAZ [7]). Protein byl izolován a mutován, aby katalyzoval jasnou a trvalou luminiscenční reakci za vzniku upravené luciferázy, NanoLuc (NLuc) a analogu coelenterazinu (furimazin), který bude použit jako buněčný reportér [5,8]. Mutovaný model pásu proteinu 19 kDa (pojmenovaný nanoKaz) je uveden na obrázek 2.

35 kDa protein

Méně známá složka enzymu OpLuc má 320 aminokyselin [3] s 11 molekulami cysteinu a 5 leucinů [4]. Amino-konec proteinu byl experimentálně konstatován tak, že začíná na 39 aminokyselinách [3]. Předpokládá se, že stabilizuje 19 kDa a nepředpokládá se, že by byl ovlivněn specificitou substrátu [3], avšak jeho přesná funkce není známa [3,4,7].

Mechanismus

Ačkoli se původně myslelo, že má přesně stejný mechanismus jako Renilla luciferáza [1], tato luminiscence má dvě možné reakční cesty [2], jak je uvedeno v obrázek 3. Na horní trase Oplophorus luciferin (coelenterazin zobrazený ve schématu jako I) se oxiduje, když se zkombinuje s O2 (v laboratorním experimentu se použil radioaktivně značený O18) ve vodném médiu a použije meziprodukt dioxetanperoxid, jehož výsledkem je produkt CO2 a coelenteramid (II ve schématu) . Dolní cesta nepoužívá meziprodukt a má rychlé výměny kyslíku s vodným médiem. Studie ukazují, že je nižší výtěžek produktu, a předpokládá se částečné zapojení do celkové reakce [2]. Je však třeba poznamenat, že je pravděpodobné, že kontaminace CO2 během experimentů prokázala vyšší výtěžek, než jaký se vyskytoval u dolní cesty, což je v přírodních podmínkách velmi nepravděpodobné [2].

Reference

1. DeLuca, M., Dempsey, M. E., Hori, K., Wampler, J. E., & Cormier, M. J. (1971). Mechanismus produkce oxidačního oxidu uhličitého během bioluminiscence Renilla reniformis. Sborník Národní akademie věd, 68(7), 1658-1660.
2. Shimomura O, Masugi T, Johnson FH, Haneda Y (1978). "Vlastnosti a reakční mechanismus bioluminiscenčního systému hlubinných krevet Oplophorus gracilorostris". Biochemie. 17 (6): 994–8. doi:10.1021 / bi00599a008. PMID  629957.
3. Shimomura O, Masugi T, Johnson FH, Haneda Y (1978). "Vlastnosti a reakční mechanismus bioluminiscenčního systému hlubinných krevet Oplophorus gracilorostris". Biochemie. 17 (6): 994–8. doi:10.1021 / bi00599a008. PMID  629957.
4. Inouye, S., & Sasaki, S. (2007). Nadměrná exprese, čištění a charakterizace katalytické složky Oplophorus luciferázy v hlubinných krevetách, Oplophorus Miloilirostris. Exprese a čištění proteinu, 56(2), 261-268.
5. Hall, M. P., Unch, J., Binkowski, B. F., Valley, M. P., Butler, B. L., Wood, M. G., ... & Robers, M. B. (2012). Vyvinutý reportér luciferázy z hlubinných krevet využívající nový imidazopyrazinonový substrát. ACS chemická biologie, 7(11), 1848-1857
6. Inouye, S., Sahara-Miura, Y., Sato, J. I., Iimori, R., Yoshida, S., & Hosoya, T. (2012). Expresní, purifikační a luminiscenční vlastnosti luciferáz využívajících coelenterazin z Renilla, Oplophorus a Gaussia: srovnání substrátové specificity pro C2-modifikované coelenteraziny. Exprese a čištění proteinů, 88(1), 150-156.
7. Inouye, S., Sato, J. I., Sahara-Miura, Y., Hosoya, T., & Suzuki, T. (2014). Nekonvenční sekrece mutovaného proteinu 19 kDa Oplophorus luciferázy (nanoKAZ) v savčích buňkách. Komunikace biochemického a biofyzikálního výzkumu, 450(4), 1313-1319.
8. Tomabechi, Y., Hosoya, T., Ehara, H., Sekine, S.I., Shirouzu, M., & Inouye, S. (2016). Krystalová struktura nanoKAZ: Mutovaná složka 19 kDa luciferázy Oplophorus katalyzující bioluminiscenční reakci s coelenterazinem. Komunikace biochemického a biofyzikálního výzkumu, 470(1), 88-93.