Protein vázající maltózu - Maltose-binding protein

Maltóza / maltodextrin vázající periplazmatický protein
Identifikátory
OrganismusEscherichia coli
SymbolMužský
UniProtP0AEX9

Protein vázající maltózu (MBP) je součástí sladový cukr /maltodextrin systém Escherichia coli, který je odpovědný za absorpci a efektivní katabolismus maltodextrinů. Jedná se o komplexní regulační a dopravní systém zahrnující mnoho bílkoviny a proteinové komplexy. MBP má přibližnou molekulovou hmotnost 42,5 kilodaltonů.

Struktura a skládání

MBP je kódován mužský gen Escherichia coli. The mužský gen kóduje prekurzorový polypeptid (396 aminokyselinových zbytků), který po odštěpení NH poskytuje zralý MBP (370 zbytků)2- koncová prodloužení (26 zbytků). Prekurzor a zralé formy MBP neobsahují žádný cysteinový zbytek.[1]

MBP je monomerní protein. Krystalové struktury ukázaly, že MBP je rozdělen do dvou odlišných globulárních domén, které jsou spojeny třemi krátkými polypeptidovými segmenty. Tyto dvě domény jsou odděleny hlubokou drážkou, která obsahuje vazebné místo pro maltózu / maltodextriny. Porovnání struktur ligandové a neligandované formy MBP ukázalo, že vazba maltózy indukuje hlavní konformační změnu, která uzavírá drážku tuhým pohybem dvou domén kolem spojovacího polypeptidového závěsu.[2][3]

Prekurzor i zralá forma MBP jsou funkční pro vazbu maltózy.[4] NH2-terminální prodloužení snižuje rychlost skládání prekurzorové formy MBP ve srovnání s její zralou formou alespoň 5krát, ale nemá žádný vliv na rychlost skládání.[5][6] Rovnovážný vývoj MBP lze modelovat dvoustavovým mechanismem se stabilitou ∆G (H2O) se rovná 9,45 kcal mol−1 při 25 ° C, pH 7,6.[7]

Lokalizace a export

MBP se exportuje do periplazmatický prostor z E-coli.[8] NH2-terminální rozšíření MBP, také nazývané signální peptid, má dvě role: (i) zpomaluje skládání nově syntetizovaného polypeptidu a (ii) směruje tento polypeptid na membránu a SecYEG translocon. Po složení nemůže prekurzor vstoupit do translokační dráhy.[9] Zavedení nabitého aminokyselinového zbytku nebo prolinového zbytku do hydrofobního jádra signálního peptidu je dostatečné k blokování exportu.[10] Defektní exporty mutantních MBP jsou v souladu s alfa-helikální konformací a hydrofobními interakcemi signálního peptidu v jeho interakci s translokonovým motorovým proteinem SecA.[11][12][13]

Kontrola výrazu

The mužský gen, kódující MBP, patří do Mal regulon z E-coli, který se skládá z deseti genů, jejichž produkty jsou zaměřeny na efektivní absorpci a využití sladový cukr a maltodextriny. Veškerý gen zapojený do transportu maltózy / maltodextrinu, včetně mužský, jsou seskupeny v malB region E-coli a uspořádány do dvou odlišných operony: malE-malF-malG a malK-lamB.[14] The transkripce začít stránky na malEp a malKp promotéři jsou vzdálené od 271 párů bází.[15]

The malEp a malKp promotory jsou synergicky aktivovány proteinem MalT, aktivátorem Mal regulon a cAMP receptorový protein CRP. Tato aktivace je spojený proces, který zahrnuje přechod z malEp vůči malKp: dvě vazebná místa MalT; tři vazebné místo CRP a dvě překrývající se sady tří vazebných míst MalT, střídané třemi páry bází.[15][16][17] Aktivace transkripce vyžaduje vazbu adenosintrifosfát (ATP) a maltotrióza k MalT a vazbě cyklický AMP do dimeru CRP.[18] Neligandovaná forma MalT je monomerní, zatímco její ligandovaná forma je v přítomnosti ATP a maltotriózy oligomerní.[19] Jeden má podezření, že komerční maltóza obsahuje dostatek maltotriózy pro indukci Mal regulonu.

Použití jako proteinový a peptidový vektor

MBP se používá ke zvýšení rozpustnosti rekombinantní proteiny vyjádřen v E-coli. V těchto systémech je požadovaný protein často vyjádřen jako MBP-fúzní protein, prevenci agregace sledovaného proteinu. Mechanismus, kterým MBP zvyšuje rozpustnost, není dobře znám. Kromě toho může být MBP sám použit jako afinitní značka pro čištění rekombinantních proteinů. Fúzní protein se váže na amylóza zatímco všechny ostatní proteiny protékají. Fúze MBP-protein může být purifikována elucí kolony maltózou. Jakmile je fúzní protein získán v purifikované formě, je požadovaný protein (X) často štěpen z MBP specifickým proteáza. Protein X pak může být oddělen od MBP pomocí afinitní chromatografie.

První studie vztahů mezi strukturou a funkcemi MBP byla provedena náhodným vložením krátkého fragmentu DNA kódujícího restrikční místo BamHI do mužský gen. Některé vložky ovlivnily funkce MBP, zatímco jiné byly tolerantní.[20][21] Permisivní místa, která byla interní vůči MBP, byla použita k vložení antigenních peptidů a stimulaci imunitní odpovědi u myší.[22] 3'-OH koncové inzerce byly použity k vytvoření fúzních proteinů a vývoji použití MBP jako afinitní rukojeti pro čištění cizích proteinů a peptidů afinitní chromatografií na zesítěné amylóze a eluci maltózou za mírných fyzikálně-chemických podmínek.[23][24] Bylo vyvinuto několik plazmidových vektorů pro usnadnění exprese a čištění těchto fúzních proteinů.[25]

Když rekombinantní MBP obsahuje signální peptid, může být fúzní protein exportován do periplazmatického prostoru, což usnadňuje jeho čištění, protože periplazmatická tekutina obsahuje pouze omezený počet proteinů a může být získána buď osmotickým šokem nebo permeabilizací vnějšího membrána s antibiotiky, např Sulfát polymyxinu B. Takový export fúzního proteinu do periplazmatického prostoru umožňuje tvorbu disulfidových vazeb v proteinu pro cestující, např. fragmenty protilátek.[26][27] Cizí bílkoviny, které jsou vyváženy vylučovány v jejich původním organismu, lze obvykle exportovat do E-coli periplazma fúzí s MBP. Mezi příklady cytoplazmatických proteinů, které lze exportovat fúzí s MBP, patří monomerní Klenow polymeráza a dimerní protein Gene V fága M13.[23][28] Když rekombinantní MBP obsahuje buď defektní nebo žádný signální peptid, fúzní protein zůstává v bakteriální cytoplazmě, odkud jej lze získat rozbitím buněk.

Fúze proteinů s MBP obvykle zvyšuje jejich rozpustnost a usnadňuje jejich správné skládání, takže fúzní proteiny jsou nejčastěji bifunkční.[23][29] Kromě toho mohou takové fúze usnadnit krystalizaci obtížných proteinů, např. membránové proteiny. Krystalizovaný protein může často mít své struktury rozlišené pomocí molekulární náhrada na známé struktuře MBP.[30]

Viz také

Reference

  1. ^ Duplay P, Bedouelle H, Fowler A, Zabin I, Saurin W, Hofnung M (srpen 1984). „Sekvence genu malE a jeho produktu, proteinu vázajícího maltózu z Escherichia coli K12“. The Journal of Biological Chemistry. 259 (16): 10606–13. PMID  6088507.
  2. ^ Spurlino JC, Lu GY, Quiocho FA (březen 1991). „Struktura rozlišení 2,3-A proteinu vázajícího maltózu nebo maltodextrin, primární receptor bakteriálního aktivního transportu a chemotaxe“. The Journal of Biological Chemistry. 266 (8): 5202–19. doi:10,2210 / pdb1mbp / pdb. PMID  2002054.
  3. ^ Sharff AJ, Rodseth LE, Spurlino JC, Quiocho FA (listopad 1992). „Krystalografický důkaz velkého ligandem indukovaného pohybu kloubu mezi dvěma doménami proteinu vázajícího maltodextrin, který se účastní aktivního transportu a chemotaxe“. Biochemie. 31 (44): 10657–63. doi:10.1021 / bi00159a003. PMID  1420181.
  4. ^ Ferenci T, Randall LL (říjen 1979). "Prekurzorový protein vázající maltózu je aktivní ve vazebném substrátu". The Journal of Biological Chemistry. 254 (20): 9979–81. PMID  385604.
  5. ^ Park S, Liu G, Topping TB, Cover WH, Randall LL (únor 1988). "Modulace skládacích drah exportovaných proteinů vedoucí sekvencí". Věda. 239 (4843): 1033–5. Bibcode:1988Sci ... 239.1033P. doi:10.1126 / science.3278378. PMID  3278378.
  6. ^ Beena K, Udgaonkar JB, Varadarajan R (březen 2004). "Vliv signálního peptidu na stabilitu a kinetiku skládání proteinu vázajícího maltózu". Biochemie. 43 (12): 3608–19. doi:10.1021 / bi0360509. PMID  15035631.
  7. ^ Chun SY, Strobel S, Bassford P, Randall LL (říjen 1993). "Skládání proteinu vázajícího na maltózu. Důkaz totožnosti kroku určujícího rychlost in vivo a in vitro". The Journal of Biological Chemistry. 268 (28): 20855–62. PMID  8407916.
  8. ^ Kellermann O, Szmelcman S (srpen 1974). "Aktivní transport maltózy v Escherichia coli K12. Zapojení" periplazmatického "proteinu vázajícího maltózu." European Journal of Biochemistry. 47 (1): 139–49. doi:10.1111 / j.1432-1033.1974.tb03677.x. PMID  4215651.
  9. ^ Randall LL, Hardy SJ (září 1986). „Korelace kompetence pro export s nedostatkem terciární struktury dospělých druhů: studie in vivo o proteinu vázajícím maltózu v E. coli“. Buňka. 46 (6): 921–8. doi:10.1016/0092-8674(86)90074-7. PMID  3530497. S2CID  28503725.
  10. ^ Bedouelle H, Bassford PJ, Fowler AV, Zabin I, Beckwith J, Hofnung M (květen 1980). "Mutace, které mění funkci signální sekvence maltózového vazebného proteinu Escherichia coli". Příroda. 285 (5760): 78–81. Bibcode:1980 Natur.285 ... 78B. doi:10.1038 / 285078a0. PMID  6990274. S2CID  4253747.
  11. ^ Bedouelle H, Hofnung M (1981). "Funkční důsledky analýzy sekundární struktury signálních peptidů divokého typu a mutantních bakteriálních signálů". Pokrok v klinickém a biologickém výzkumu. 63: 399–403. PMID  7312870.
  12. ^ Chou YT, Gierasch LM (září 2005). "Konformace signálního peptidu vázaného preproteinem Escherichia coli translocase SecA". The Journal of Biological Chemistry. 280 (38): 32753–60. doi:10,1074 / jbc.M507532200. PMID  16046390.
  13. ^ Gelis I, Bonvin AM, Keramisanou D, Koukaki M, Gouridis G, Karamanou S, Economou A, Kalodimos CG (listopad 2007). "Strukturální základna pro rozpoznání signální sekvence translocase motorem SecA, jak je stanoveno NMR". Buňka. 131 (4): 756–69. doi:10.1016 / j.cell.2007.09.039. PMC  2170882. PMID  18022369.
  14. ^ Boos W, Shuman H (březen 1998). „Systém maltózy / maltodextrinu Escherichia coli: transport, metabolismus a regulace“. Recenze mikrobiologie a molekulární biologie. 62 (1): 204–29. doi:10.1128 / MMBR.62.1.204-229.1998. PMC  98911. PMID  9529892.
  15. ^ A b Bedouelle H, Schmeissner U, Hofnung M, Rosenberg M (listopad 1982). „Propagátoři operonů malEFG a malK-lamB v Escherichia coli K12“. Journal of Molecular Biology. 161 (4): 519–31. doi:10.1016/0022-2836(82)90405-3. PMID  6185687.
  16. ^ Bedouelle H (listopad 1983). „Mutace v promotorových oblastech operonů malEFG a malK-lamB Escherichia coli K12“. Journal of Molecular Biology. 170 (4): 861–82. doi:10.1016 / s0022-2836 (83) 80192-2. PMID  6417341.
  17. ^ Richet E (říjen 2000). „Synergická aktivace transkripce: dvojí role CRP při aktivaci promotoru Escherichia coli v závislosti na MalT a CRP“. Časopis EMBO. 19 (19): 5222–32. doi:10.1093 / emboj / 19.19.5222. PMC  302108. PMID  11013224.
  18. ^ Richet E, Raibaud O (březen 1989). „MalT, regulační protein maltózového systému Escherichia coli, je transkripční aktivátor závislý na ATP“. Časopis EMBO. 8 (3): 981–7. doi:10.1002 / j.1460-2075.1989.tb03461.x. PMC  400900. PMID  2524384.
  19. ^ Schreiber V, Richet E (listopad 1999). „Vlastní asociace transkripčního aktivátoru Escherichia coli MalT v přítomnosti maltotriózy a ATP“. The Journal of Biological Chemistry. 274 (47): 33220–6. doi:10.1074 / jbc.274.47.33220. PMID  10559195.
  20. ^ Duplay P, Bedouelle H, Szmelcman S, Hofnung M (1985). „Linkerová mutageneze v genu kódujícím periplazmatický protein vázající maltózu z E. coli“. Biochimie. 67 (7–8): 849–51. doi:10.1016 / s0300-9084 (85) 80178-4. PMID  3002495.
  21. ^ Duplay P, Szmelcman S, Bedouelle H, Hofnung M (duben 1987). „Tiché a funkční změny v periplazmatickém proteinu vázajícím maltózu Escherichia coli K12. I. Transport maltózy“. Journal of Molecular Biology. 194 (4): 663–73. doi:10.1016/0022-2836(87)90243-9. PMID  2821264.
  22. ^ Coëffier E, Clément JM, Cussac V, Khodaei-Boorane N, Jehanno M, Rojas M, Dridi A, Latour M, El Habib R, Barré-Sinoussi F, Hofnung M, Leclerc C (listopad 2000). "Antigenicita a imunogenicita epitopu HIV-1 gp41 ELDKWA vloženého do permisivních míst proteinu MalE". Vakcína. 19 (7–8): 684–93. doi:10.1016 / s0264-410x (00) 00267-x. PMID  11115689.
  23. ^ A b C Bedouelle H, Duplay P (únor 1988). "Produkce v Escherichia coli a jednokrokové čištění bifunkčních hybridních proteinů, které vážou maltózu. Export Klenow polymerázy do periplazmatického prostoru". European Journal of Biochemistry. 171 (3): 541–9. doi:10.1111 / j.1432-1033.1988.tb13823.x. PMID  3278900.
  24. ^ Rondard P, Brégégère F, Lecroisey A, Delepierre M, Bedouelle H (červenec 1997). "Konformační a funkční vlastnosti undekapeptidového epitopu fúzovaného s C-terminálním koncem proteinu vázajícího maltózu". Biochemie. 36 (29): 8954–61. CiteSeerX  10.1.1.599.2650. doi:10.1021 / bi962508d. PMID  9220983.
  25. ^ di Guan C, Li P, Riggs PD, Inouye H (červenec 1988). "Vektory, které usnadňují expresi a čištění cizích peptidů v Escherichia coli fúzí s proteinem vázajícím maltózu". Gen. 67 (1): 21–30. doi:10.1016/0378-1119(88)90004-2. PMID  2843437.
  26. ^ Brégégère F, Schwartz J, Bedouelle H (únor 1994). „Bifunkční hybridy mezi variabilními doménami imunoglobulinu a proteinem vázajícím maltózu z Escherichia coli: produkce, čištění a vazba antigenu“. Proteinové inženýrství. 7 (2): 271–80. PMID  8170930.
  27. ^ Malik A (červen 2016). "Proteinové fúzní značky pro efektivní expresi a čištění rekombinantních proteinů v periplazmatickém prostoru E. coli". 3 Biotech. 6 (1): 44. doi:10.1007 / s13205-016-0397-7. PMC  4742420. PMID  28330113.
  28. ^ Blondel A, Bedouelle H (říjen 1990). „Export a čištění cytoplazmatického dimerního proteinu fúzí s proteinem vázajícím maltózu z Escherichia coli.“ European Journal of Biochemistry. 193 (2): 325–30. doi:10.1111 / j.1432-1033.1990.tb19341.x. PMID  2226455.
  29. ^ Kapust RB, Waugh DS (srpen 1999). „Protein vázající maltózu z Escherichia coli je neobvykle účinný při podpoře rozpustnosti polypeptidů, ke kterým je fúzován.“. Věda o bílkovinách. 8 (8): 1668–74. doi:10.1110 / ps.8.8.1668. PMC  2144417. PMID  10452611.
  30. ^ Waugh DS (březen 2016). „Krystalové struktury fúzních proteinů MBP“. Věda o bílkovinách. 25 (3): 559–71. doi:10.1002 / pro.2863. PMC  4815407. PMID  26682969.

externí odkazy