Amorpha-4,11-dien syntáza - Amorpha-4,11-diene synthase

Amorpha-4,11-dien syntáza
Identifikátory
EC číslo4.2.3.24
Databáze
IntEnzIntEnz pohled
BRENDAVstup BRENDA
EXPASYPohled NiceZyme
KEGGVstup KEGG
MetaCycmetabolická cesta
PRIAMprofil
PDB strukturRCSB PDB PDBe PDBsum

v enzymologie, an amorpha-4,11-dien syntáza (REKLAMY) (ES 4.2.3.24 ) je enzym že katalyzuje the chemická reakce

2-trans, 6-trans-farnesyl difosfát ⇌ amorpha-4,11-dien + difosfát

Tento enzym tedy jeden má Podklad, 2-trans, 6-trans-farnesyl difosfát a dva produkty, amorpha-4,11-dien a difosfát.

Tento enzym patří do rodiny lyázy konkrétně ty lyázy uhlík-kyslík působící na fosfáty. The systematické jméno této třídy enzymů je 2-trans, 6-trans-farnesyl-difosfát-difosfát-lyáza (tvořící amorf-4,11-dien). Tento enzym se také nazývá amorfadien syntáza.

Tento enzym se vyskytuje hlavně v Artemisia annua, mírná asijská nativní kvetoucí rostlina, a ADS katalyzuje první spáchaný krok v antimalarickém léčivu artemisinin syntéza.

Vlastnosti enzymu

Fyzikální vlastnosti

Amorpha-4,11-dien syntáza je protein dlouhý 533 aminokyselin s molekulovou hmotností 62,2 kDa a izoelektrický bod z 5,25.[1][nespolehlivý zdroj? ]

ADS vykazuje optimální pH při pH 6,5 a minimum při pH 7,5.

S Mg2+, Mn2+ a spol2+ jako kofaktory byla pozorována velká aktivita enzymu s Ni2+, nízká aktivita pozorována, a s Cu2+ a Zn2+v podstatě nebyla pozorována žádná aktivita.[2]

Vývoj

ADS je vysoce konzervovaný protein podobný ostatním proteinům s analogickou funkčností. Dedukovaná aminokyselinová sekvence je 32 až 51% identická se sekvencí jiných známých sesquiterpenových cykláz z krytosemenné rostliny (kvetoucí rostliny), což znamená, že enzymy mají společný původ.[3] Přesněji řečeno, má vysoce konzervované vazebné místo pro substrát s aspartát bohatý motiv DDxxD.[1]

Výraz

ADS je vyjádřen 16krát vyšší v listech než v kořenech Artemisia annua rostlin a 10krát vyšší než u stonků vykazujících tkáňově specifický expresní vzor.[4]

produkty

Zatímco amorpha-4,11-dien je hlavním projektem ADS, bylo prokázáno, že čištěný enzym produkuje alespoň 16 různých produktů. Mezi tyto další produkty patří olefiny (E) -β-farnesen, amorpha-4,7 (11) -dien, γ-humulen a β-sesquiphellandren a okysličené sesquiterpeny amorpha-4-en-11-ol, amorpha-4 -en-7-ol a a-bisabolol.[2] Asi 97,5% výrobků je olefiny a dalších 2,5% jsou okysličené seskviterpeny.[3]

Obrázek 1: Regulace ADS pomocí SS mRNA

Nařízení

Dvě formy regulace ADS zahrnují indukci prostředí a biochemické regulační přepínače. Za normálních podmínek se ADS vyjadřuje na nízké úrovni v Artemisia annua; při vystavení chladu, tepelnému šoku nebo UV záření se však ADS zvýší.[5] Odpovídá tomu v přírodě, aklimatizované za studena Artemisia annua vyjadřují vyšší hladiny ADS než rostliny za normálních podmínek.[6]

Regulační přepínače pomáhají kontrolovat úrovně ADS. Protože enzymový substrát Farnesyl difosfát má mnoho dalších využití kromě tvorby amorfha-4,11-dienu, tyto další cesty regulují ADS. Jednou takovou cestou je biosyntéza sterolu a ve skutečnosti enzym skvalen syntáza (SS) je považován za regulační přepínač pro ADS. Když SS cDNA, což snižuje SS mRNA koncentrace, a proto snižuje expresi SS, zavádí se do rostlinných buněk, dramaticky se zvyšuje hladina mRNA ADS [7](Obrázek 1).

Mechanismus

ADS katalyzuje reakci farnesyl difosfát (FPP) do amorpha-4,11-dien (Obrázek 2).

Obrázek 2: Mechanismus reklam

Experimentálními daty byl podporován následující mechanismus reakce:[8]

  1. Izomerizace FPP na (R) -nerolidyl difosfát (NPP)
  2. Ionizace JE
  3. Uzávěr kruhu C-1, C-6 k vytvoření bisaboyl kationtu
  4. 1,3-hydridový posun
  5. 1,10-prstencový uzávěr
  6. Deprotonace buď na C-12 nebo C-13

Průmyslové aplikace

Amorpha-4-11-dien syntáza katalyzuje první krok v syntéze antimalarického léčiva artemisinin konverzí všudypřítomné farnesyl difosfát do předchůdce amorpha-4,11-dien.[9][10] Armorpha-4,11-dien prochází několika kroky, aby se stal kyselinou artemisinovou a nakonec artemisininem (Obrázek 3).

Obrázek 23 Amorpha-4,11-dien na artemisinin

Artemisinin je přirozeně syntetizován původní čínskou rostlinou Artemisia annua; avšak kvůli nízkým výtěžkům rostlinné tkáňové extrakce a dlouhým vegetačním obdobím včetně alternativních způsobů metabolické inženýrství uvažuje se o produkci artemisininu.[11] ADS byl klonován a exprimován v bakteriálních buňkách jako způsob produkce artemisininu.[12] Protože ADS je prvním závazným a limitujícím krokem biosyntézy artemisininu, mělo by zvýšení hladin ADS zvýšit výtěžek artemisininu. ADS však není jediným hrdlem lahve při výrobě artemisininu, takže ke zvýšení výtěžku jsou zapotřebí další geny.[13] Způsob, jak toho dosáhnout, bylo zvýšit tok směrem k ADS produkcí více FPP z mevalonát cesta. Ve skutečnosti byla nadměrná exprese Amorpha-4-11-dien syntázy spojená s expresí kvasinek mevalonát cesta prokázala zvýšení výtěžku a produkce prekurzoru artemisininu amorpha-4,11-dienu.[14]

Vědci ze společnosti Amyris vyvinuli metodu pro vysokou produkci artemisininu. Jedním ze syntetických genů v tomto postupu je ADS z Artemisia annua. Polosyntetická produkce artemisininu společností Amyris má potenciál snížit náklady na antimalarickou léčbu, a tím je snadno získat pro rozvojový svět.[15]

Reference

  1. ^ A b Alam P, Kiran U, Ahmad MM, Kamaluddin, Khan MA, Jhanwar S, Abdin M (2010). „Izolace, charakterizace a strukturní studie amorfní - 4, 11-dien syntázy (ADS (3963)) z Artemisia annua L“. Bioinformace. 4 (9): 421–9. doi:10.6026/97320630004421. PMC  2951637. PMID  20975893.
  2. ^ A b Picaud S, Olofsson L, Brodelius M, Brodelius PE (2005). "Exprese, čištění a charakterizace rekombinantní amorfha-4,11-diensyntázy z Artemisia annua L". Oblouk. Biochem. Biophys. 436 (2): 215–26. doi:10.1016 / j.abb.2005.02.012. PMID  15797234.
  3. ^ A b Mercke P, Bengtsson M, Bouwmeester HJ, Posthumus MA, Brodelius PE (2000). „Molekulární klonování, exprese a charakterizace amorpha-4,11-dien syntázy, klíčového enzymu biosyntézy artemisininu v Artemisia annua L“. Oblouk. Biochem. Biophys. 381 (2): 173–80. doi:10.1006 / abbi.2000.1962. PMID  11032404.
  4. ^ Wen W, Yu R (2011). „Biosyntéza artemisininu a jeho regulační enzymy: pokrok a perspektiva“. Pharmacogn Rev. 5 (10): 189–94. doi:10.4103/0973-7847.91118. PMC  3263054. PMID  22279377.
  5. ^ Yin L, Zhao C, Huang Y, Yang RY, Zeng QP (2008). „Exprese genů biosyntézy artemisininu vyvolaná abiotickým stresem v Artemisia annua“. Appl Environ Biol. 14: 1–5.
  6. ^ Zeng QP, Zeng XM, Yin LL, Fent LL, Yang XQ (2009). „Kvantifikace tří klíčových enzymů podílejících se na biogenezi artemisininu v Artemisia annua pomocí polyklonální ELISA na bázi antiséra“. Plant Mol Biol. 27 (50): 7. doi:10.1007 / s11105-008-0056-1.
  7. ^ Feng LL, Yang RY, Yang XQ, Zeng XM, Lu WJ, Zeng QP (2009). „Synergické přesměrování cesty mevalonátu pro zvýšenou produkci artemisininu v transgentní Artemisia annua“. Plant Sci. 177: 57–67. doi:10.1016 / j.plantsci.2009.03.014.
  8. ^ Picaud S, Mercke P, He X, Sterner O, Brodelius M, Cane DE, Brodelius PE (2006). „Amorpha-4,11-dien syntáza: mechanismus a stereochemie enzymatické cyklizace farnesyl difosfátu“. Oblouk. Biochem. Biophys. 448 (1–2): 150–5. doi:10.1016 / j.abb.2005.07.015. PMID  16143293.
  9. ^ Posthumus MA, Schmidt CO, De Kraker JW, Konig WA, Franssen MC (1999). „Amorpha-4,11-dien syntáza katalyzuje první pravděpodobný krok v biosyntéze artemisininu“. Fytochemie. 52 (5): 843–54. doi:10.1016 / S0031-9422 (99) 00206-X. PMID  10626375.
  10. ^ Wallaart TE, Bouwmeester HJ, Hille J, Poppinga L, Maijers NC (2001). „Amorpha-4,11-dien syntáza: klonování a funkční exprese klíčového enzymu v biosyntetické cestě nového antimalarického léčiva artemisininu“ (PDF). Planta. 212 (3): 460–5. doi:10,1007 / s004250000428. PMID  11289612.
  11. ^ Tsuruta H, Paddon CJ, Eng D, Lenihan JR, Horning T, Anthony LC, Regentin R, Keasling JD, Renninger NS, Newman JD (2009). „Vysoká produkce amorpha-4,11-dienu, prekurzoru antimalarického činidla artemisininu, v Escherichia coli“. PLOS ONE. 4 (2): e4489. doi:10.1371 / journal.pone.0004489. PMC  2637983. PMID  19221601.
  12. ^ Chang YJ, Song SH, Park SH, Kim SU (2000). „Amorpha-4,11-dien syntáza Artemisia annua: izolace cDNA a bakteriální exprese terpenové syntázy zapojené do biosyntézy artemisininu“. Oblouk. Biochem. Biophys. 383 (2): 178–84. doi:10.1006 / abbi.2000.2061. PMID  11185551.
  13. ^ Liu B, Wang H, Du Z, Li G, Ye H (2011). "Metabolické inženýrství biosyntézy artemisininu v Artemisia annua L". Rep. Rostlinných buněk. 30 (5): 689–94. doi:10.1007 / s00299-010-0967-9. PMID  21184232.
  14. ^ Martin VJ, Pitera DJ, Withers ST, Newman JD, Keasling JD (2003). "Inženýrství mevalonátové dráhy v Escherichia coli pro výrobu terpenoidů". Nat. Biotechnol. 21 (7): 796–802. doi:10.1038 / nbt833. PMID  12778056.
  15. ^ Paddon CJ, Westfall PJ, Pitera DJ, Benjamin K, Fisher K, McPhee D, Leavell MD, Tai A, Main A, Eng D, Polichuk DR, Teoh KH, Reed DW, Treynor T, Lenihan J, Fleck M, Bajad S , Dang G, Dengrove D, Diola D, Dorin G, Ellens KW, Fickes S, Galazzo J, Gaucher SP, Geistlinger T, Henry R, ​​Hepp M, Horning T, Iqbal T, Jiang H, Kizer L, Lieu B, Melis D, Moss N, Regentin R, Secrest S, Tsuruta H, Vazquez R, Westblade LF, Xu L, Yu M, Zhang Y, Zhao L, Lievense J, Covello PS, Keasling JD, Reiling KK, Renninger NS, Newman JD ( 2013). „Vysoko-polosyntetická produkce silného antimalarického artemisininu“. Příroda. 496 (7446): 528–32. doi:10.1038 / nature12051. PMID  23575629.