Barvení stříbrem - Silver staining

v patologie, barvení stříbrem je použití stříbrný selektivně změnit vzhled cíle v mikroskopie z histologické řezy; v gelová elektroforéza s teplotním gradientem; a v polyakrylamidové gely.

V tradičním vitráže, stříbrná skvrna je technika k výrobě žlutých až oranžových nebo hnědých odstínů (nebo zelených na modrém skleněném základu) přidáním směsi obsahující sloučeniny stříbra (zejména dusičnan stříbrný ) a lehce střílí. To bylo představeno brzy po 1800, a je “skvrna” v termínu “vitráže”. stříbrný sloučeniny[1] jsou smíchány s pojivovými látkami, naneseny na povrch skla a poté vypáleny v peci nebo peci.[2][3]

Dějiny

Camillo Golgi zdokonalené barvení stříbrem pro studium nervový systém. Přesný chemický mechanismus, kterým k tomu dochází, není znám,[4] Golgiho metoda skvrny náhodně v celém rozsahu omezeného počtu buněk.[5]

Barvení stříbrem zavedli Kerenyi a Gallyas jako citlivou proceduru pro detekci stopových množství proteinů gely.[6] Tato technika byla rozšířena na studium dalších biologických makromolekuly které byly odděleny v různých podpěrách.[7]

Klasický Coomassie Brilliant Blue barvení může obvykle detekovat 50 ng proteinový pás; barvení stříbrem zvyšuje citlivost obvykle 50krát.

Mnoho proměnných může ovlivnit barva intenzita a každý protein má své vlastní charakteristiky barvení; čisté sklo, čistá činidla a voda nejvyšší čistoty jsou klíčovými body pro úspěšné barvení.[8]

Chemie

Některé buňky jsou argentafin. Tyto snížit stříbrný roztok na kovové stříbro po formalín fixace. Ostatní buňky jsou argyrofilní. Ty redukují roztok stříbra na kovové stříbro poté, co byly vystaveny skvrně obsahující a redukční činidlo, například hydrochinon nebo formalin.

Dusičnan stříbrný tvoří nerozpustné fosforečnan stříbrný s fosfát ionty; tato metoda je známá jako Von Kossa Stain. Při vystavení redukčnímu činidlu obvykle hydrochinon, tvoří černé základní stříbro. To se používá ke studiu tvorby fosforečnan vápenatý částice během růstu kostí.

Aplikace

Histologická charakterizace

Barvení stříbrem napomáhá vizualizaci sledovaných cílů, zejména intracelulárních a extracelulárních buněčných složek, jako jsou DNA a bílkoviny, jako je typ III kolagen a retikulin vlákna nanášením kovových částic stříbra na sledované cíle.[9]

Diagnostická mikrobiologie

Pseudomonas,[10] Legionella, Leptospira, H. pylori, Bartonella a Treponema a houby jako Pneumocystis, Cryptococcus, a Candida jsou organismy obarvené stříbrem.[Citace je zapotřebí ]

Analýza karyotypů

Barvení stříbrem se používá v karyotypizace. Dusičnan stříbrný skvrny na oblast nukleární organizace (NOR) asociovaný protein, produkující tmavou oblast, kde se ukládá stříbro a označuje aktivitu rRNA geny v NOR. Člověk chromozomy 13, 14, 15, 21 a 22 mají NOR, které zvyšují aktivitu barvení stříbrem nejméně 50krát.[Citace je zapotřebí ]

Genomická a proteomická analýza

Barvení stříbrem se používá k barvení gelů. Stříbrná skvrna bílkovin v Agarózové gely byl vyvinut v roce 1973 Kerenyim a Gallyasem.[11] Později to bylo přizpůsobeno polyakrylamidové gely použito v SDS-PAGE,[12][13][14][15][16] a také pro barvení DNA nebo RNA.[17] The glykosylace z glykoproteiny a polysacharidy lze oxidovat 1hodinovou předúpravou 0,1% kyselina jodistá při 4 ° C, což zlepšuje vazbu iontů stříbra a výsledek barvení.[18]

Nejprve jsou proteiny denaturovány v gelu 10% fixačním roztokem octová kyselina a 30% ethanol a vysráží se zároveň čisticí prostředek (většinou BL ) se extrahuje. The difúze bílkovin je tak významně snížena. Po opakovaném promytí vodou se gel inkubuje v a dusičnan stříbrný řešení. Ionty stříbra se vážou na negativně nabité postranní řetězce proteinů. Přebytečné ionty stříbra se poté odmyjí vodou. V závěrečném vývojovém kroku se ionty stříbra redukují na elementární stříbro přidáním zásady formaldehyd. To zabarví místa, kde jsou přítomny proteiny, od hnědé po černou.

Intenzita barvení závisí na primární struktura bílkoviny. Navíc čistota použitých nádob a čistota činidla ovlivnit stříbrnou skvrnu.[19] Běžné artefakty ve stříbrem obarvených gelech jsou pásy keratin v rozmezí 54-57 kDa a 65-68 kDa[20] jako kontaminace vzorku před elektroforézou.

Skvrny od methenaminového stříbra

Existuje několik stříbrných skvrn methenamin, počítaje v to:

Galerie

  • Stříbrná skvrna (GMS ) demonstrace houby Histoplazma (černé kulaté kuličky) v biopsii jater.

  • Řada vzorků DNA ze vzorků Littorina plena zesílen pomocí PCR s primery zaměřenými na proměnnou jednoduché opakování sekvence (SSR, aka mikrosatelit) lokus. Vzorky byly zpracovány na 5% polyakrylamidovém gelu a vizualizovány pomocí barvení stříbrem.

  • RBC membránové proteiny oddělené SDS-PAGE a postříbřené.[21]

Reference

  1. ^ Steinhoff, Frederick Louis (1973). Keramický průmysl. Industrial Publications, Incorporated.
  2. ^ Chambersova encyklopedie. Pergamon Press. 1967.
  3. ^ „Fakta o skle: stříbrná skvrna“ „Boppard Conservation Project - Glasgow Museums; Praktická ochrana budov: sklo a zasklenítím, že Historická Anglie 2011, Ashgate Publishing, Ltd., ISBN  0754645576, 9780754645573, google knihy, str. 290
  4. ^ Golgi C (1873). „Sulla struttura della sostanza grigia del cervello“. Gazzetta Medica Italiana (Lombardia). 33: 244–246.
  5. ^ Grant G (říjen 2007). „Jak Golgi a Cajal sdíleli Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu z roku 1906“. Brain Res Rev. 55 (2): 490–498. doi:10.1016 / j.brainresrev.2006.11.004. PMID  17306375.
  6. ^ Kerenyi L, Gallyas F (1973). „Über Probleme der quantitiven Auswertung der mit physikalischer Entwicklung versilberten Agarelektrophoretogramme“. Clin. Chim. Acta. 47 (3): 425–436. doi:10.1016/0009-8981(73)90276-3. PMID  4744834.
  7. ^ Switzer RC 3., Merril CR, Shifrin S (září 1979). „Vysoce citlivé stříbrné barvivo pro detekci proteinů a peptidů v polyakrylamidových gelech“. Anální. Biochem. 98 (1): 231–237. doi:10.1016/0003-2697(79)90732-2. PMID  94518.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  8. ^ Hempelmann E, Schulze M, Götze O ​​(1984). „Volné SH-skupiny jsou důležité pro polychromatické barvení proteinů dusičnanem stříbrným.“ Neuhof V (Ed) Electrophoresis '84, Verlag Chemie Weinheim 1984: 328–330.
  9. ^ Schwint OA, Labraga M, Cervino CO, Haffar M, Sequeiros PH, Marcos HJ (2004). "Modifikace barvicí techniky retikulárních vláken pro analýzu obrazu srdeční kolagenové sítě". Cardiovasc. Pathol. 13 (4): 213–20. doi:10.1016 / S1054-8807 (03) 00153-4. PMID  15210137.
  10. ^ Barnini S, Dodi C, Campa M (2004). "Zvýšené rozlišení náhodně amplifikované polymorfní DNA genotypizace Pseudomonas aeruginosa". Lett. Appl. Microbiol. 39 (3): 274–7. doi:10.1111 / j.1472-765X.2004.01576.x. PMID  15287874.
  11. ^ Kerényi L, Gallyas F (září 1973). "[Chyby v kvantitativních odhadech na agarové elektroforéze pomocí stříbrného barvení]". Clin. Chim. Acta. 47: 425–36. doi:10.1016/0009-8981(73)90276-3. PMID  4744834.
  12. ^ Merril CR, Switzer RC, Van Keuren ML (1979). „Stopové polypeptidy v buněčných extraktech a lidských tělních tekutinách detekované dvourozměrnou elektroforézou a vysoce citlivým stříbrným zabarvením“. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9): 4335–9. doi:10.1073 / pnas.76.9.4335. PMC  411569. PMID  92027.
  13. ^ R. C. Switzer, C. R. Merril, S. Shifrin (září 1979), „Vysoce citlivé stříbrné barvivo pro detekci proteinů a peptidů v polyakrylamidových gelech“, Anal Biochem (v němčině), 98 (1), s. 231–237, doi:10.1016/0003-2697(79)90732-2, PMID  94518CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  14. ^ Rabilloud T a kol. (1988). "Vylepšení a zjednodušení barvení proteinů stříbrem na nízkém pozadí pomocí dithioničitanu sodného". Elektroforéza. 9 (6): 288–291. doi:10,1002 / elps.1150090608. PMID  2466660.
  15. ^ Rabilloud T (1992). "Srovnání skvrn diaminu stříbrného s nízkým pozadím a bílkovin dusičnanu stříbrného". Elektroforéza. 13 (7): 429–439. doi:10,1002 / elps.1150130190. PMID  1425556.
  16. ^ Lelong C, Chevallet M, Luche S, Rabilloud T (2009). Barvení bílkovin stříbrem ve 2DE gelech (PDF). Methods Mol Biol. 519. 339–350. doi:10.1007/978-1-59745-281-6_21. ISBN  978-1-58829-937-6. PMID  19381593.
  17. ^ Blum H, Beier H, Gross HJ (1987). "Vylepšené barvení rostlinných bílkovin, RNA a DNA v gelech PAA". Elektroforéza. 8: 93–99. doi:10,1002 / elps.1150080203.
  18. ^ Dubray G, Bezard G (1982). „Vysoce citlivé barvivo kyselina jodistá na stříbro pro 1,2-diolové skupiny glykoproteinů a polysacharidů v polyakrylamidových gelech“. Anální. Biochem. 119 (2): 325–329. doi:10.1016/0003-2697(82)90593-0. PMID  6176144.
  19. ^ E. Hempelmann, M. Schulze, O. Götze: Volné skupiny SH jsou důležité pro polychromatické barvení proteinů dusičnanem stříbrným. In: V. Neuhof (redaktor): Elektroforéza. Verlag Chemie, Weinheim, 1984, s. 328–330.
  20. ^ Ochs D (1983). „Proteinové kontaminanty gelů dodecylsulfát-polyakrylamid sodný“. Anal Biochem. 135 (2): 470–4. doi:10.1016/0003-2697(83)90714-5. PMID  6197906.
  21. ^ Hempelmann E, Götze O ​​(1984). "Charakterizace membránových proteinů polychromatickým barvením stříbrem". Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem. 365: 241–242.

externí odkazy

  • MedEd v Loyole Histo / praktické / skvrny / hp2-55.html
  • [1] Hempelmann E. SDS-Proteinová stránka a detekce proteinů barvením stříbrem a imunoblotováním proteinů Plasmodium falciparum. in: Moll K, Ljungström J, Perlmann H, Scherf A, Wahlgren M (eds) Methods in Malaria Research, 5. vydání, 2008, 263-266