SDS-PAGE - SDS-PAGE

Bílkoviny červená krvinka membrány oddělené pomocí SDS-PAGE podle jejich molekulových hmot

SDS-PAGE (elektroforéza na gelu dodecylsulfát-polyakrylamid sodný), je diskontinuální elektroforetický systém vyvinutý uživatelem Ulrich K. Laemmli který se běžně používá jako metoda k oddělení bílkoviny s molekulovou hmotností mezi 5 a 250 kDa.[1] [2] Kombinované použití dodecylsulfátu sodného (SDS, také známého jako laurylsulfát sodný) a polyakrylamidového gelu umožňuje eliminovat vliv struktury a náboje a proteiny se oddělí pouze na základě rozdílů v jejich molekulové hmotnosti.

Vlastnosti

Rozvíjení proteinu pomocí SDS
Rozvíjení proteinu teplem

SDS-PAGE je metoda elektroforézy, která umožňuje hmotnostní separaci proteinů. Médium (označované také jako „matice“) je diskontinuální gel na bázi polyakrylamidu. Kromě toho bezpečnostní listy (dodecylsulfát sodný ) se používá. Asi 1,4 gramu SDS se váže na gram bílkoviny,[3][4][5] což odpovídá jedné molekule SDS na dvě aminokyseliny. SDS funguje jako povrchově aktivní látka, maskující vnitřní náboj proteinů a udělující jim velmi podobné poměry náboje k hmotnosti. Vnitřní náboje proteinů jsou ve srovnání s náplní SDS zanedbatelné a pozitivní náboje jsou také výrazně sníženy v základním rozmezí pH separačního gelu. Po aplikaci konstantního elektrického pole protein migruje směrem k anodě, každá s jinou rychlostí, v závislosti na její hmotnosti. Tento jednoduchý postup umožňuje přesnou hmotnostní separaci proteinů.

SDS má tendenci tvořit sférický tvar micely ve vodných roztocích nad určitou koncentraci zvanou kritická micelární koncentrace (CMC). Nad kritickou micelární koncentrací 7 až 10 milimolárních v roztocích se SDS současně vyskytuje jako jednotlivé molekuly (monomer ) a jako micely se pod CMC SDS vyskytuje pouze jako monomery ve vodných roztocích. Při kritické micelární koncentraci se micela skládá z přibližně 62 molekul SDS.[6] Avšak pouze SDS monomery se vážou na proteiny hydrofobními interakcemi, zatímco SDS micely jsou zvnějšku aniontové a neabsorbují žádný protein.[3] SDS má amfipatickou povahu, což mu umožňuje rozvinout polární i nepolární úseky proteinové struktury.[7] V koncentracích SDS nad 0,1 milimolární začíná odvíjení proteinů,[3] a nad 1 mM je většina proteinů denaturována.[3] Vzhledem k silnému denaturačnímu účinku SDS a následné disociaci proteinových komplexů kvartérní struktury nelze obecně určit pomocí bezpečnostního listu. Výjimkou jsou proteiny, které jsou stabilizovány kovalentem síťování např. -S-S- vazby a SDS-rezistentní proteinové komplexy, které jsou stabilní i za přítomnosti SDS (druhý je však pouze při teplotě místnosti). K denaturaci komplexů odolných vůči SDS je zapotřebí vysoká aktivační energie, které se dosáhne zahřátím. Rezistence SDS je založena na metastabilitě proteinového záhybu. Ačkoli nativní, plně složený, SDS-rezistentní protein nemá dostatečnou stabilitu v přítomnosti SDS, chemická rovnováha denaturace při pokojové teplotě dochází pomalu. Stabilní proteinové komplexy se vyznačují nejen odolností vůči SDS, ale také stabilitou proti proteázy a zvýšené biologický poločas.[8]

Alternativně lze elektroforézu na polyakrylamidovém gelu provádět také s kationtovými povrchově aktivními látkami CTAB na stránce CTAB,[9][10][11] nebo 16-BAC na BAC-STRÁNCE.[12]

Postup

Metoda SDS-PAGE se skládá z přípravy gelu, přípravy vzorků, elektroforézy, barvení proteinů nebo western blot a analýza vygenerovaného pruhu.

Výroba gelu

Ukázkové hřebeny s různým počtem kapes, každý hrot po vytažení zanechává kapsu v gelu
Polymerovaný oddělovací a stohovací gel před odstraněním hřebenu vzorku (bílý) mezi distančními prvky (černý), ve stohovacím gelu jsou malá množství bromofenolové modři pro lepší viditelnost, oddělovací gel není zbarvený

Při použití různých pufrů v gelu (diskontinuální gelová elektroforéza) se gely připraví až jeden den před elektroforézou, takže difúze nevede ke smíchání pufrů. Gel vyrábí společnost radikální polymerace ve formě skládající se ze dvou utěsněných skleněných desek s rozpěrami mezi skleněnými deskami. V typickém nastavení mini-gelu mají rozpěrky tloušťku 0,75 mm nebo 1,5 mm, což určuje nosnost gelu. Pro nalití gelového roztoku jsou desky obvykle upnuty ve stojanu, který dočasně utěsní jinak otevřenou spodní stranu skleněných desek pomocí dvou rozpěrek. V případě gelového roztoku se akrylamid smísí jako látka vytvářející gel (obvykle 4% V / V v stohovacím gelu a 10 - 12% v separačním gelu), methylenebisakrylamid jako zesíťovač, stohovací nebo separační gelový pufr, voda a SDS . Přidáním katalyzátoru TEMED a radikální iniciátor persíran amonný (APS) je zahájena polymerace. Roztok se poté nalije mezi skleněné desky bez vytváření bublin. V závislosti na množství katalyzátoru a radikálového startéru a v závislosti na teplotě polymerace trvá mezi čtvrtinou a několika hodinami. Dolní gel (separační gel) se nalije jako první a pokryje se několika kapkami sotva rozpustného alkoholu (obvykle pufrem nasyceného butanolu nebo isopropanolu), který eliminuje bubliny z meniskus a chrání gelový roztok radikální mrchožrout kyslík. Po polymeraci oddělovacího gelu se alkohol odloží a zbytkový alkohol se odstraní pomocí filtrační papír. Po přidání APS a TEMED do stohovacího gelového roztoku se nalije na horní část pevného separačního gelu. Poté se mezi skleněné desky vloží vhodný hřeben na vzorky, aniž by se vytvořily bubliny. Hřeben na vzorek je po polymeraci opatrně vytažen a zůstávají kapsy pro aplikaci vzorku. Pro pozdější použití proteinů pro sekvenování proteinů, gely se často připravují den před elektroforézou ke snížení reakcí nepolymerizovaného akrylamidu s cysteiny v bílkovinách.

Použitím a gradientní mixér Lze odlévat gradientové gely s gradientem akrylamidu (obvykle od 4 do 12%), které mají větší separační rozsah molekulových hmot.[13] Komerční gelové systémy (tzv prefabrikované gely) obvykle používají pufrovací látku Bis-tris metan s hodnotou pH mezi 6,4 a 7,2 jak ve stohovacím gelu, tak v separačním gelu.[14][15] Tyto gely jsou dodávány lité a připravené k použití. Protože používají pouze jednu vyrovnávací paměť (kontinuální gelová elektroforéza ) a mají téměř neutrální pH, lze je skladovat několik týdnů. Čím neutrálnější pH zpomaluje hydrolýzu a tím i rozklad polyakrylamidu. Kromě toho je v proteinech méně cysteinů modifikovaných akrylamidem.[14] Díky konstantnímu pH při sběru a oddělování gelu nedochází ke stohování. Bílkoviny v gelu BisTris nelze obarvit komplexy ruthenia.[16] Tento gelový systém má poměrně velký separační rozsah, který lze měnit použitím MES nebo MOPS v běžící vyrovnávací paměti.[14]

příprava vzorků

Redukce disulfidu pomocí DTT

Během přípravy vzorku se k proteinům přidává nadbytek pufru, a tedy SDS, a vzorek se poté zahřívá na 95 ° C po dobu pěti minut, nebo alternativně na 70 ° C po dobu deseti minut. Vytápění narušuje sekundární a terciární struktury narušení proteinu Vodíkové vazby a roztahování molekul. Volitelně disulfidové můstky lze štěpit redukcí. Za tímto účelem snižování thioly jako β-merkaptoethanol (β-ME, 5% objemových), dithiothreitol (DTT, 10 milimolárních) nebo dithioerythritol (DTE, 10 milimolární) se přidají do vzorkového pufru. Po ochlazení na teplotu místnosti se každý vzorek napipetuje do vlastní jamky v gelu, který se předtím ponoří do elektroforetického pufru v elektroforetickém přístroji.

Kromě vzorků, a marker velikosti molekulové hmotnosti je obvykle nanesen na gel. Skládá se z proteinů známých velikostí, a tím umožňuje odhad (s chybou ± 10%) velikostí proteinů ve skutečných vzorcích, které migrují paralelně v různých stopách gelu.[17] Značka velikosti se často pipetuje do první nebo poslední kapsy gelu.

Elektroforéza

Elektroforetická komora po několika minutách elektroforézy. V první kapse byl nanesen značkovač velikosti bromfenolovou modří, do ostatních kapes byly přidány vzorky bromkrezolová zelená

Pro separaci jsou denaturované vzorky naneseny na gel polyakrylamidu, který je umístěn do elektroforetického pufru s vhodnými elektrolyty. Poté, a Napětí (obvykle kolem 100 V, 10-20 V na cm délky gelu), což způsobí migraci negativně nabitých molekul přes gel ve směru kladně nabitého anoda. Gel působí jako síto. Malé proteiny migrují relativně snadno sítem gelu, zatímco větší proteiny jsou pravděpodobněji zadrženy, a tím migrují pomaleji gelem, což umožňuje oddělit proteiny podle velikosti molekul. Elektroforéza trvá mezi půlhodinou a několika hodinami v závislosti na napětí a délce použitého gelu.

Nejrychleji migrující proteiny (s molekulovou hmotností menší než 5 kDa) tvoří přední část pufru společně s aniontovými složkami elektroforetického pufru, které také migrují gelem. Plocha čela pufru je zviditelněna přidáním poměrně malého aniontového barviva bromfenolová modrá do vzorkového pufru. Vzhledem k relativně malé velikosti molekuly bromofenolové modři migruje rychleji než bílkoviny. Optickým ovládáním migrujícího barevného pásu lze elektroforézu zastavit před barvivem a také vzorky zcela migrují gelem a opouštějí jej.

Nejběžněji používanou metodou je diskontinuální SDS-PAGE. U této metody proteiny migrují nejprve do sběrného gelu s neutrálním pH, ve kterém jsou koncentrovány, a poté migrují do separačního gelu se zásaditým pH, ve kterém probíhá skutečná separace. Stohování a oddělování gelů se liší různými způsoby pór velikost (4–6% T a 10–20% T), iontová síla a hodnoty pH (pH 6,8 nebo pH 8,8). Nejčastěji používaným elektrolytem je SDS Tris -glycin -chlorid nárazník Systém. Při neutrálním pH tvoří glycin převážně zwitterionický ve formě, při vysokém pH ztrácejí glyciny kladné náboje a stávají se převážně aniontovými. Ve sběrném gelu migrují menší, negativně nabité chloridové ionty před proteiny (jako vedoucí ionty) a o něco větší, negativně a částečně pozitivně nabité glycinátové ionty migrují za proteiny (jako počáteční koncové ionty), zatímco ve srovnání základní separační gel oba ionty migrují před proteiny. Gradient pH mezi stohovacími a separačními gelovými pufry vede k stohovacímu efektu na hranici stohovacího gelu k separačnímu gelu, protože glycinát částečně ztrácí své zpomalující kladné náboje, jak se zvyšuje pH, a poté, jak předchozí koncové ionty předběhnou proteiny a stane se vedoucím iontem, což způsobí, že se pruhy různých proteinů (viditelné po barvení) zúží a ostřeji - efekt skládání. Pro separaci menších proteinů a peptidů je TRIS-Tricin pufrovací systém Schäggera a von Jagowa se používá kvůli vyššímu šíření proteinů v rozmezí 0,5 až 50 kDa.[18]

Gelové barvení

10% gel Tris / Tricine obarvený Coomassie. V levém pruhu byl k odhadu velikosti použit marker velikosti molekulové hmotnosti (shora dolů: 66, 45, 35, 24, 18 a 9 kDa). Ve zbývajících pruzích byly vyčištěné kvasinkové proteiny odděleny.

Na konci elektroforetické separace jsou všechny proteiny tříděny podle velikosti a poté mohou být analyzovány jinými metodami, např. G. barvení proteinů, jako je Coomassie barvení (nejběžnější a snadno použitelné),[19][20] barvení stříbrem (nejvyšší citlivost),[21][22][23][24][25][26] skvrny všechny barvení, Amido černá 10B barvení,[20] Rychle zelená FCF barvení,[20] fluorescenční skvrny jako např epikokonon skvrna[27] a SYPRO oranžová skvrna,[28] a imunologická detekce, jako je Western Blot.[29][30] Fluorescenční barviva mají srovnatelně vyšší linearitu mezi množstvím proteinu a intenzitou barev asi o tři řády nad detekční limit, i. E. množství proteinu lze odhadnout podle intenzity barvy. Při použití fluorescenčního proteinového barviva trichlorethanol, následné barvení proteinem je vynecháno, pokud bylo přidáno do roztoku gelu a gel byl po elektroforéze ozářen UV zářením.[31][32]

v Coomassie Barvení, gel je fixován v 50% ethanolu 10% ledové kyselině octové po dobu 1 hodiny. Poté se roztok vymění za čerstvý a po 1 až 12 hodinách se gel vymění za barvicí roztok (50% methanolu, 10% ledové kyseliny octové, 0,1% Coomassie Brilliant Blue) a následuje několikanásobné odbarvení odbarvovacího roztoku 40% methanol, 10% ledová kyselina octová.

Analýza

Barvení bílkovin v gelu vytváří dokumentovatelný pruhovaný vzor různých proteinů. Glykoproteiny mají rozdílné úrovně glykosylace a adsorbovat SDS nerovnoměrněji na glykosylaci, což vede k širším a rozmazaným pásmům.[33] Membránové proteiny, kvůli jejich transmembránová doména, jsou často složeny z více hydrofobních aminokyselin, mají nižší rozpustnost ve vodných roztocích mají tendenci se vázat lipidy a mají tendenci se srážet ve vodných roztocích v důsledku hydrofobní účinky pokud není přítomno dostatečné množství pracího prostředku. Toto srážení se u membránových proteinů projevuje v SDS-PAGE v „koncové části“ nad pásem transmembránového proteinu. V tomto případě lze použít více SDS (použitím více nebo více koncentrovaného pufru pro vzorky) a množství proteinu v aplikaci vzorku lze snížit. Přetížení gelu rozpustným proteinem vytváří půlkruhový pás tohoto proteinu (např. V markerové dráze obrazu při 66 kDa), což umožňuje pokrytí dalších proteinů s podobnými molekulovými hmotnostmi. Nízký kontrast (jako v pruhu markerů obrazu) mezi pásy v pruhu naznačuje buď přítomnost mnoha proteinů (nízká čistota), nebo pokud se používají purifikované proteiny a nízký kontrast nastává pouze pod jedním pásem, znamená to proteolytickou degradaci proteinu, který nejprve způsobí degradační pásy a po další degradaci vytvoří homogenní barvu („stěr“) pod pásem.[34] Dokumentace pruhovacího vzoru se obvykle provádí fotografováním nebo skenováním. Pro následné získání molekul v jednotlivých pásech, a extrakce gelu lze provést.

Archivace

Dva SDS gely po úplném oddělení vzorků a barvení v sušicím rámu

Po obarvení proteinem a dokumentaci pruhovacího vzoru může být polyakrylamidový gel vysušen pro archivaci. Proteiny z něj lze extrahovat později. Gel se umístí buď do sušicího rámu (s použitím tepla nebo bez něj) nebo do vakuové sušičky. Sušicí rám se skládá ze dvou částí, z nichž jedna slouží jako podklad pro mokré celofán film, ke kterému gel a jedno procento glycerol přidá se roztok. Poté se aplikuje druhý mokrý celofánový film bez bublin, druhá část rámu se umístí na vrchol a rám se utěsní sponami. Odstranění vzduchových bublin zabrání fragmentaci gelu během sušení. Voda se odpařuje přes celofánový film. Na rozdíl od sušicího rámce vytváří vakuová sušička vakuum a zahřívá gel na přibližně 50 ° C.

Stanovení molekulové hmotnosti

Proteiny markeru velikosti (černé X) vykazují přibližně přímku ve znázornění log M přes Rf. Molekulární hmotnost neznámého proteinu (červené X) lze určit na ose y.

Pro přesnější stanovení molekulové hmotnosti se v separačním gelu měří relativní migrační vzdálenosti jednotlivých proteinových pásů.[35][36] Pro zvýšení přesnosti se měření obvykle provádějí trojmo. Relativní pohyblivost (nazývaná hodnota Rf nebo hodnota Rm) je kvocient vzdálenosti pásma proteinu a vzdálenosti čela pufru. Vzdálenosti pásů a čela pufru se měří od začátku separačního gelu. Vzdálenost čela pufru zhruba odpovídá vzdálenosti bromfenolové modři obsažené ve vzorkovém pufru. Relativní vzdálenosti proteinů markeru velikosti jsou vyneseny semilogaritmicky proti jejich známým molekulárním hmotnostem. Porovnáním s lineární částí generovaného grafu nebo regresní analýzou lze molekulovou hmotnost neznámého proteinu určit jeho relativní mobilitou. Skupiny proteinů s glykosylací mohou být rozmazané.[33] Proteiny s mnoha základními aminokyselinami (např. histony )[37] může vést k nadhodnocení molekulové hmotnosti nebo dokonce vůbec nemigrovat do gelu, protože se v elektroforéze pohybují pomaleji kvůli kladným nábojům nebo dokonce opačným směrem. Mnoho kyselých aminokyselin tedy může vést k urychlené migraci proteinu a podhodnocení jeho molekulové hmotnosti.[38]

Aplikace

SDS-PAGE v kombinaci s barvivem na proteiny je široce používán v biochemii pro rychlou a přesnou separaci a následnou analýzu proteinů. Má srovnatelně nízké náklady na nástroje a činidla a je snadno použitelnou metodou. Kvůli jeho nízké hodnotě škálovatelnost, většinou se používá pro analytické účely a méně pro účely přípravy, zvláště když se má izolovat větší množství proteinu.

Navíc se SDS-PAGE používá v kombinaci s western blot pro stanovení přítomnosti specifického proteinu ve směsi proteinů - nebo pro analýzu posttranslační úpravy. Posttranslační modifikace proteinů mohou vést k odlišné relativní mobilitě (tj posun pásma) nebo ke změně vazby detekční protilátky použité při westernovém přenosu (tj. pás zmizí nebo se objeví).

v hmotnostní spektrometrie proteinů je SDS-PAGE široce používanou metodou pro přípravu vzorků před spektrometrií, většinou s použitím trávení v gelu. Pokud jde o stanovení molekulové hmotnosti proteinu, SDS-PAGE je o něco přesnější než analytická ultracentrifugace, ale méně přesné než a hmotnostní spektrometrie nebo - ignorování posttranslačních úprav - výpočet molekulové hmotnosti proteinu z Sekvence DNA.

V lékařské diagnostice se SDS-PAGE používá jako součást Test na HIV a vyhodnotit proteinurie. V testu HIV jsou proteiny HIV odděleny pomocí SDS-PAGE a následně detekovány Western Blot s HIV-specifickým protilátky pacienta, pokud jsou přítomny v jeho krevní sérum. SDS-PAGE pro proteinurii hodnotí různé hladiny sérové ​​proteiny v moči, např. Albumin, Alfa-2-makroglobulin a IgG.

Varianty

SDS-PAGE je nejpoužívanější metodou pro gelovou elektroforetickou separaci proteinů. Dvourozměrná gelová elektroforéza postupně kombinuje izoelektrické zaostřování nebo BAC-PAGE s SDS-PAGE. Nativní stránka se používá, pokud má být zachováno skládání nativního proteinu. Pro separaci membránových proteinů lze jako alternativu k SDS-PAGE použít BAC-PAGE nebo CTAB-PAGE. Pro elektroforetickou separaci větších proteinových komplexů elektroforéza na agarózovém gelu lze použít např. the SDD-AGE. Nějaký enzymy lze detekovat pomocí jejich aktivita enzymu podle zymografie.

Alternativy

Přestože je SDS-PAGE jednou z nejpřesnějších a nejlevnějších metod separace a analýzy proteinů, denaturuje proteiny. Pokud jsou nezbytné nedenaturační podmínky, jsou proteiny odděleny nativní PAGE nebo jinou chromatografické metody s následnými fotometrické kvantifikace, například afinitní chromatografie (nebo dokonce tandemové afinitní čištění ), vylučovací chromatografie, iontoměničová chromatografie.[39] Proteiny lze také rozdělit podle velikosti v a tangenciální filtrace toku[40] nebo ultrafiltrace.[41] Jednotlivé proteiny lze izolovat ze směsi afinitní chromatografií nebo a rozbalovací test. Některé historicky časné a nákladově efektivní, ale surové separační metody obvykle založené na sérii extrakce a srážky použitím kosmotropní molekuly, například srážení síranem amonným a polyethylenglykol srážky.

Dějiny

V roce 1948 Arne Tiselius byl oceněn Nobelova cena za chemii za objev principu elektroforézy jako migrace nabitých a rozpuštěných atomů nebo molekul v elektrickém poli.[42] Použití pevné matrice (původně papírové disky) v a zónová elektroforéza zlepšilo oddělení. Nespojitá elektroforéza z roku 1964 L. Ornsteina a B. J. Davise umožnila zlepšit separaci pomocí efektu skládání.[43] Použití zesítěných polyakrylamidových hydrogelů, na rozdíl od dříve používaných papírových disků nebo škrobových gelů, poskytlo vyšší stabilitu gelu a žádný mikrobiální rozklad. Denaturační účinek SDS v kontinuálních polyakrylamidových gelech a následné zlepšení rozlišení byl poprvé popsán v roce 1965 autorem David F. Summers v pracovní skupině James E. Darnell oddělit proteiny polioviru.[44] Současnou variantu SDS-PAGE popsal v roce 1970 Ulrich K. Laemmli a zpočátku se používal k charakterizaci proteinů v hlavě bakteriofág T4.[1] Tento Laemmliho článek je široce citován pro vynález moderní SDS-PAGE, ale tuto techniku ​​ve skutečnosti vynalezl Jake Maizel, který dělal volno v laboratoři MRC, když Laemmli nastoupil do laboratoře jako postdoktorand. Maizel sdílel svou předchozí technologii s Laemmli a společně provedli další vylepšení. Laemmli a Maizel plánovali navázat s metodickým papírem, ale nikdy se to neuskutečnilo. Maizel líčí historii vývoje SDS-PAGE v krátkém komentáři.[45]

Reference

  1. ^ A b Laemmli, Velká Británie (1970). „Štěpení strukturních proteinů během shromáždění vedoucího bakteriofága T4“. Příroda. 227 (5259): 680–685. Bibcode:1970Natur.227..680L. doi:10.1038 / 227680a0. ISSN  0028-0836. PMID  5432063. S2CID  3105149.
  2. ^ Neue Zürcher Zeitung: Rozhovor s Ulrichem Lämmlim v němčině. NZZ Folio, č. 11, 2005. Zpřístupněno 4. března 2012.
  3. ^ A b C d Reynolds JA, Charles Tanford (1970). „Vazba dodecylsulfátu na proteiny při vysokých vazebných poměrech. Možné důsledky pro stav proteinů v biologických membránách“. Proc Natl Acad Sci U S A. 66 (3): 1002–7. Bibcode:1970PNAS ... 66.1002R. doi:10.1073 / pnas.66.3.1002. PMC  283150. PMID  5269225.
  4. ^ Smith, B. J. (1984). "SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza proteinů". Proteiny. Metody v molekulární biologii. 1. 41–56. doi:10.1385/0-89603-062-8:41. ISBN  0-89603-062-8. PMID  20512673.
  5. ^ Staikos, Georgios; Dondos, Anastasios (2009). „Studie komplexů dodecylsulfátu sodného a bílkovin: důkaz jejich červovité konformace tím, že se s nimi zachází jako s náhodnými polymery cívky“. Koloidní a polymerní věda. 287 (8): 1001–1004. doi:10.1007 / s00396-009-2059-3. ISSN  0303-402X. S2CID  97367384.
  6. ^ Turro, Nicholas J .; Yekta, Ahmad (1978). "Luminiscenční sondy pro roztoky detergentů. Jednoduchý postup pro stanovení průměrného agregačního počtu micel". Journal of the American Chemical Society. 100 (18): 5951–5952. doi:10.1021 / ja00486a062. ISSN  0002-7863.
  7. ^ Berg, Jeremy M. (08.04.2015). Biochemie. Tymoczko, John L., 1948-, Gatto, Gregory J., Jr. (Gregory Joseph), Stryer, Lubert. (Osmá ed.). New York. ISBN  9781464126109. OCLC  913469736.
  8. ^ Manning M, Colón W (2004). „Strukturní základ kinetické stability bílkovin: rezistence na dodecylsulfát sodný naznačuje ústřední roli tuhosti a zkreslení vůči struktuře beta-listu“. Biochemie. 43 (35): 11248–54. doi:10.1021 / bi0491898. PMID  15366934.
  9. ^ Buxbaum, Engelbert (2003). "Kationtová elektroforéza a elektrotransfer membránových glykoproteinů". Analytická biochemie. 314 (1): 70–76. doi:10.1016 / S0003-2697 (02) 00639-5. ISSN  0003-2697. PMID  12633604.
  10. ^ Akin, Dianne T .; Shapira, Raymond; Kinkade, Joseph M. (1985). "Stanovení molekulárních hmotností biologicky aktivních proteinů pomocí cetyltrimethylamoniumbromid-polyakrylamidové gelové elektroforézy". Analytická biochemie. 145 (1): 170–176. doi:10.1016/0003-2697(85)90343-4. ISSN  0003-2697. PMID  4003759.
  11. ^ Simpson, R. J. (2010). "CTAB-PAGE". Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4): pdb.prot5412. doi:10.1101 / pdb.prot5412. ISSN  1559-6095. PMID  20360366.
  12. ^ Hartinger, Joachim; Stenius, Katinka; Högemann, Dagmar; Jahn, Reinhard (1996). „16-BAC / SDS – STRÁNKA: Dvourozměrný gelový elektroforetický systém vhodný pro separaci integrálních membránových proteinů“. Analytická biochemie. 240 (1): 126–133. doi:10.1006 / abio.1996.0339. ISSN  0003-2697. PMID  8811889.
  13. ^ Margolis J, Kenrick KG (1969). „2-dimenzionální rozlišení plazmatických proteinů kombinací polyakrylamidového disku a gradientové gelové elektroforézy“. Příroda. 221 (5185): 1056–7. Bibcode:1969Natur.221.1056M. doi:10.1038 / 2211056a0. PMID  5774398. S2CID  4197850.
  14. ^ A b C Hachmann, John P .; Amshey, Joseph W. (2005). „Modely modifikace bílkovin v gelech Tris – glycin a Bis – Tris s neutrálním pH během elektroforézy: Účinek pH gelu“. Analytická biochemie. 342 (2): 237–245. doi:10.1016 / j.ab.2005.04.015. ISSN  0003-2697. PMID  15935323.
  15. ^ Wiltfang, Jens; Arold, Norbert; Neuhoff, Volker (1991). „Nový vícefázový pufrovací systém pro elektroforézu proteinů a peptidů na gelu dodecylsulfát-polyakrylamid sodný s molekulovou hmotností 100 000–1000 a jejich detekce pomocí pikomolární citlivosti“. Elektroforéza. 12 (5): 352–366. doi:10,1002 / elps.1150120507. ISSN  0173-0835. PMID  1718736. S2CID  40101706.
  16. ^ Moebius, Jan; Denker, Katrin; Sickmann, Albert (2007). „Truthenium (II) tris-bathofenanthrolindisulfonát je vhodný pro Tris-Glycine PAGE, ale ne pro Bis-Tris gely.“ Proteomika. 7 (4): 524–527. doi:10.1002 / pmic.200600642. ISSN  1615-9853. PMID  17309097. S2CID  25822873.
  17. ^ Ian M. Rosenberg (22. prosince 2006). Analýza a čištění proteinů: Benchtop Techniques. Springer Science & Business Media. 103–. ISBN  978-0-8176-4412-3.
  18. ^ Schägger, Hermann; von Jagow, Gebhard (1987). „Tricin-dodecylsulfát sodný-polyakrylamidová gelová elektroforéza pro separaci proteinů v rozmezí od 1 do 100 kDa“. Analytická biochemie. 166 (2): 368–379. doi:10.1016/0003-2697(87)90587-2. ISSN  0003-2697. PMID  2449095.
  19. ^ Fazekas de St. Groth, S .; Webster, R. G .; Datyner, A. (1963). "Dva nové postupy barvení pro kvantitativní odhad proteinů na elektroforetických proužcích". Biochimica et Biophysica Acta. 71: 377–391. doi:10.1016/0006-3002(63)91092-8. PMID  18421828.
  20. ^ A b C Wilson CM (1979). „Studie a kritika Amido Black 10B, Coomassie Blue R a Fast Green FCF jako barviva pro proteiny po elektroforéze na polyakrylamidovém gelu“. Anal Biochem. 96 (2): 263–78. doi:10.1016/0003-2697(79)90581-5. PMID  89822.
  21. ^ Merril, C. R.; Switzer, R. C .; Keuren, M. L. Van (1979). „Stopové polypeptidy v buněčných extraktech a lidských tělních tekutinách detekované dvourozměrnou elektroforézou a vysoce citlivým stříbrným zabarvením“. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9): 4335–4339. Bibcode:1979PNAS ... 76,4335M. doi:10.1073 / pnas.76.9.4335. PMC  411569. PMID  92027.
  22. ^ R. C. Switzer, C. R. Merril, S. Shifrin (září 1979), „Vysoce citlivé stříbrné barvivo pro detekci proteinů a peptidů v polyakrylamidových gelech“, Anal Biochem (v němčině), 98 (1), s. 231–237, doi:10.1016/0003-2697(79)90732-2, PMID  94518CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  23. ^ Blum, H .; Beier, H .; Gross, J. J. (1987). "Vylepšené barvení rostlinných bílkovin, RNA a DNA v gelech PAA". Elektroforéza. 8: 93–99. doi:10,1002 / elps.1150080203. S2CID  84471792.
  24. ^ Rabilloud, T .; et al. (1988). "Vylepšení a zjednodušení barvení proteinů stříbrem na nízkém pozadí pomocí dithioničitanu sodného". Elektroforéza. 9 (6): 288–291. doi:10,1002 / elps.1150090608. PMID  2466660. S2CID  33007991.
  25. ^ Rabilloud, T. (1992). "Srovnání skvrn diaminu stříbrného s nízkým pozadím a bílkovin dusičnanu stříbrného". Elektroforéza. 13 (7): 429–439. doi:10,1002 / elps.1150130190. PMID  1425556. S2CID  43084621.
  26. ^ Lelong, C .; Chevallet, M .; Luche, S .; Rabilloud, T. (2009). Barvení bílkovin stříbrem ve 2DE gelech (PDF). Methods Mol Biol. 519. 339–350. doi:10.1007/978-1-59745-281-6_21. ISBN  978-1-58829-937-6. PMID  19381593. S2CID  52820065.
  27. ^ Moritz, Christian P .; Marz, Sabrina X .; Reiss, Ralph; Schulenborg, Thomas; Friauf, Eckhard (únor 2014). "Barvení epikokononem: výkonná kontrola načítání pro Western bloty.". Proteomika. 14 (2–3): 162–8. doi:10.1002 / pmic.201300089. PMID  24339236. S2CID  206368546.
  28. ^ Aleksandr Petrovič Demčenko: Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology III: Applications in Sensing and Imaging Band 3 von Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology. Springer 2011, ISBN  978-3-642-18035-4, S. 179ff.
  29. ^ Gallagher, Sean; Chakavarti, Deb (2008). „Barvení proteinů v gelech“. Žurnál vizualizovaných experimentů (17). doi:10.3791/760. ISSN  1940-087X. PMC  3253607. PMID  19066521.
  30. ^ Wilson CM (1983). „Barvení proteinů na gelech: srovnání barviv a postupů“. Metody Enzymol. 91: 236–47. doi:10.1016 / s0076-6879 (83) 91020-0. PMID  6190068.
  31. ^ Ladner CL, Yang J, Turner RJ, Edwards RA (2004). "Viditelná fluorescenční detekce proteinů v polyakrylamidových gelech bez barvení". Anal Biochem. 326 (1): 13–20. doi:10.1016 / j.ab.2003.10.047. PMID  14769330.
  32. ^ Gilda JE, Gomes AV (2013). „Barvení celkového proteinu bez skvrn je pro Western bloty lepší kontrolou zátěže β-aktinu“. Anal Biochem. 440 (2): 186–8. doi:10.1016 / j.ab.2013.05.027. PMC  3809032. PMID  23747530.
  33. ^ A b Cryo-EM Část A: Příprava vzorků a sběr dat. Akademický tisk. 30. září 2010. str. 28. ISBN  978-0-08-095695-4.
  34. ^ Richard R Burgess; Murray P. Deutscher (3. listopadu 2009). Průvodce purifikací bílkovin. Akademický tisk. str. 184–. ISBN  978-0-08-092317-8.
  35. ^ Philip L.R. Bonner; Alan J. Hargreaves (24. srpna 2011). Basic Bioscience Laboratory Techniques: A Pocket Guide. John Wiley & Sons. str. 140–. ISBN  978-1-119-95644-0.
  36. ^ Martin Holtzhauer (13. září 2006). Základní metody pro biochemickou laboratoř. Springer Science & Business Media. str. 243–. ISBN  978-3-540-32786-8.
  37. ^ W. J. van Venrooij; Ravinder N.Maini (6. prosince 2012). Manuál biologických markerů nemoci. Springer Science & Business Media. str. 50–. ISBN  978-94-011-1670-1.
  38. ^ Guan, Yihong; Zhu, Qinfang; Huang, Delai; Zhao, Shuyi; Jan Lo, Li; Peng, Jinrong (2015). "Rovnice pro odhad rozdílu mezi teoreticky předpovězenou a SDS PAGE zobrazenou molekulovou hmotností pro kyselý peptid". Vědecké zprávy. 5 (1): 13370. Bibcode:2015NatSR ... 513370G. doi:10.1038 / srep13370. ISSN  2045-2322. PMC  4550835. PMID  26311515.
  39. ^ Jan-Christer Janson (3. ledna 2012). Purifikace bílkovin: Principy, metody s vysokým rozlišením a aplikace. John Wiley & Sons. ISBN  978-1-118-00219-3.
  40. ^ Mohamed A. Desai (2000). Následné zpracování proteinů: metody a protokoly. Springer Science & Business Media. str. 35. ISBN  978-1-59259-027-8.
  41. ^ Ghosh Raja (11. června 2003). Bioseparace proteinů pomocí ultrafiltrace: teorie, aplikace a nový vývoj. World Scientific. str. 142. ISBN  978-1-78326-126-0.
  42. ^ Pederson, T. (2007). „Turning a PAGE: the night sensation of SDS-polycrylamide gel elektroforéza.“ FASEB Journal. 22 (4): 949–953. doi:10.1096 / fj.08-0402ufm. ISSN  0892-6638. PMID  18378803. S2CID  33466516.
  43. ^ Ornstein, L .; Davis, B.J. (1964). „Disková elektroforéza –1. Pozadí a teorie“. Ann NY Acad Sci. 121 (2): 321–349. Bibcode:1964NYASA.121..321O. doi:10.1111 / j.1749-6632.1964.tb14207.x. PMID  14240533. S2CID  28591995.
  44. ^ Summers DF, Maizel JV, Darnell JE (1965). „Důkazy o virově specifických nekapsidových proteinech v buňkách HeLa infikovaných poliovirem“. Proc Natl Acad Sci U S A. 54 (2): 505–13. Bibcode:1965PNAS ... 54..505S. doi:10.1073 / pnas.54.2.505. PMC  219696. PMID  4285933.
  45. ^ Maizel, Jr, J (2000-12-01). "SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza". Trendy v biochemických vědách. 25 (12): 590–592. doi:10.1016 / S0968-0004 (00) 01693-5. PMID  11116183.

externí odkazy