Dvourozměrná gelová elektroforéza - Two-dimensional gel electrophoresis

2D gely (barvené Coomassie)
V moderních laboratořích se používají k izolaci proteinových skvrn z 2D gelů.

Dvourozměrná gelová elektroforéza, zkráceně jako 2-DE nebo 2-D elektroforéza, je forma Gelová elektroforéza běžně používané k analýze bílkoviny. Směsi proteinů jsou na 2D gelech odděleny dvěma vlastnostmi ve dvou rozměrech. 2-DE byl poprvé nezávisle představen O'Farrelle[1] a Klose[2] v roce 1975.

Základ pro oddělení

2-D elektroforéza začíná elektroforézou v první dimenzi a poté odděluje molekuly kolmo od první k vytvoření elektroferogram ve druhé dimenzi. Při elektroforéze v první dimenzi jsou molekuly odděleny lineárně podle svého izoelektrického bodu. Ve druhé dimenzi jsou molekuly poté odděleny v úhlu 90 stupňů od prvního elektroferogramu podle molekulové hmotnosti. Vzhledem k tomu, že je nepravděpodobné, že si dvě molekuly budou podobné ve dvou odlišných vlastnostech, jsou molekuly účinněji odděleny ve 2-D elektroforéze než v 1-D elektroforéze.

Mohou být dvě dimenze, na které jsou proteiny rozděleny pomocí této techniky izoelektrický bod, hmota proteinového komplexu v rodák stát nebo protein Hmotnost.

Separace proteinů izoelektrickým bodem se nazývá izoelektrické zaostřování (IEF). Tím se na gel aplikuje gradient pH a na gel se aplikuje elektrický potenciál, čímž je jeden konec pozitivnější než druhý. Při všech hodnotách pH jiných než jejich izoelektrický bod budou proteiny nabity. Pokud jsou kladně nabité, budou vytaženy směrem k zápornějšímu konci gelu a pokud jsou záporně nabité, budou vytaženy na kladnější konec gelu. Proteiny aplikované v první dimenzi se budou pohybovat po gelu a budou se hromadit v jejich izoelektrickém bodě; tj. bod, ve kterém je celkový náboj na proteinu 0 (neutrální náboj).

Pro analýzu fungování proteinů v a buňka, znalost jejich spolupráce je zásadní. Nejčastěji proteiny působí společně v komplexech, aby byly plně funkční. Analýza tohoto sub organela Organizace buňky vyžaduje techniky zachování původního stavu proteinové komplexy. Při elektroforéze nativního polyakrylamidového gelu (nativní PAGE ), proteiny zůstávají ve svém přirozeném stavu a jsou oddělovány v elektrickém poli sledujícím jejich hmotnost a hmotnost jejich komplexů. Aby se dosáhlo separace podle velikosti a nikoli podle čistého náboje, jako v IEF, přenáší se na proteiny další náboj pomocí Coomassie Brilliant Blue nebo dodecylsulfát lithný. Po dokončení první dimenze jsou komplexy zničeny aplikací denaturační SDS-PAGE ve druhé dimenzi, kde jsou proteiny, ze kterých jsou komplexy složeny, odděleny svou hmotou.

Před hmotnou separací jsou proteiny ošetřeny dodecylsulfát sodný (SDS) spolu s dalšími činidly (SDS-PAGE v 1-D). To denaturuje proteiny (to znamená, že se rozloží na dlouhé přímé molekuly) a váže několik molekul SDS zhruba úměrných délce proteinu. Protože délka proteinu (je-li rozložená) je zhruba úměrná jeho hmotnosti, odpovídá to tomu, že se k němu váže řada molekul SDS zhruba úměrných hmotnosti proteinu. Vzhledem k tomu, že molekuly SDS jsou záporně nabité, výsledkem toho je, že všechny proteiny budou mít přibližně stejný poměr hmotnost k náboji jako každý jiný. Kromě toho proteiny nebudou migrovat, pokud nemají náboj (výsledek kroku izoelektrického zaostřování), proto povlak proteinu v SDS (záporně nabitý) umožňuje migraci proteinů ve druhé dimenzi (SDS-PAGE, není kompatibilní pro použití v první dimenzi, protože je nabitá a je třeba použít neiontový nebo zwitteriontový detergent) .V druhé dimenzi je opět aplikován elektrický potenciál, ale v úhlu 90 stupňů od prvního pole. Proteiny budou přitahovány k pozitivnější straně gelu (protože SDS je záporně nabitý) úměrně jejich poměru hmotnosti k náboji. Jak již bylo vysvětleno dříve, tento poměr bude téměř stejný pro všechny proteiny. Postup proteinů bude zpomalen třecími silami. Gel se proto při aplikaci proudu chová jako molekulární síto, které odděluje proteiny na základě jejich molekulové hmotnosti, přičemž větší proteiny jsou zadržovány výše v gelu a menší proteiny jsou schopné projít sítem a dosáhnout nižších oblastí gelu .

Detekce proteinů

Výsledkem je gel s bílkovinami rozprostřenými na jeho povrchu. Tyto proteiny lze poté detekovat různými způsoby, ale nejčastěji používané skvrny jsou stříbrný a Coomassie Brilliant Blue barvení. V prvním případě se na gel nanese koloidní stříbro. Stříbro se váže na cysteinové skupiny v proteinu. Stříbro ztmavne vystavením ultrafialovému světlu. Množství stříbra může souviset s temnotou, a tedy s množstvím proteinu v daném místě gelu. Toto měření může poskytnout pouze přibližné množství, ale pro většinu účelů je dostačující. Barvení stříbrem je stokrát citlivější než Coomassie Brilliant Blue se 40násobným rozsahem linearity.[3]

Molekuly jiné než proteiny lze oddělit 2D elektroforézou. v supercoiling testy, stočené DNA je oddělen v první dimenzi a denaturován interkalátorem DNA (např ethidiumbromid nebo méně karcinogenní chlorochin ) ve druhém. To je srovnatelné s kombinací nativní PAGE / SDS-PAGE při separaci proteinů.

Běžné techniky

IPG-DALT

Běžnou technikou je použití Imobilizovaný gradient pH (IPG) v první dimenzi. Tato technika se označuje jako IPG-DALT. Vzorek se nejprve rozdělí na IPG gel (který je komerčně dostupný), poté se gel rozřezá na plátky pro každý vzorek, který se poté ekvilibruje v SDS-merkaptoethanolu a nanese na SDS-PAGE gel pro rozlišení ve druhé dimenzi. Typicky se IPG-DALT nepoužívá ke kvantifikaci proteinů kvůli ztrátě složek s nízkou molekulovou hmotností během přenosu na gel SDS-PAGE.[4]

IEF SDS-PAGE

Vidět Isoelektrické zaostřování

Software pro analýzu 2D gelu

Hlavní článek: Software pro 2D gelovou analýzu
Pokřivení: Snímky dvou 2D elektroforézních gelů překrytých Delta2D. První obrázek je zbarven oranžově, druhý modře. Kvůli běžným rozdílům se odpovídající místa nepřekrývají.
Pokřivení: Snímky dvou 2D elektroforézových gelů po pokřivení. První obrázek je zbarven oranžově, druhý modře. Odpovídající místa se po deformaci překrývají. Běžné skvrny jsou černé, oranžové skvrny jsou přítomny pouze (nebo mnohem silnější) na prvním obrázku, modré skvrny jsou přítomny pouze (nebo mnohem silnější) na druhém obrázku.

v kvantitativní proteomika, tyto nástroje primárně analyzují bio-markery kvantifikací jednotlivých proteinů a zobrazením separace mezi jednou nebo více proteinovými "skvrnami" na naskenovaném obrázku 2-DE gelu. Tyto nástroje navíc srovnávají skvrny mezi gely podobných vzorků, aby ukázaly například proteomické rozdíly mezi časnými a pokročilými stadii onemocnění. Mezi softwarové balíčky patří mimo jiné Delta2D, ImageMaster, Melanie, PDQuest, Progenesis a REDFIN.[Citace je zapotřebí ] I když je tato technologie široce využívána, inteligence nebyla zdokonalena. Například zatímco PDQuest a Progenesis mají tendenci se shodovat na kvantifikaci a analýze dobře definovaných dobře oddělených proteinových skvrn, přinášejí odlišné výsledky a analytické tendence s méně definovanými méně oddělenými skvrnami.[5]

Výzvy pro automatickou softwarovou analýzu zahrnují neúplně oddělená (překrývající se) místa (méně definovaná a / nebo oddělená), slabá místa / šum (např. „Místa duchů“), rozdíly v běhu mezi gely (např. Protein migruje do různých pozic na různé gely), neporovnatelné / nezjištěné skvrny, vedoucí k chybějící hodnoty,[6][7] neodpovídající skvrny, chyby v kvantifikaci (software může chybně detekovat několik odlišných skvrn jako jeden bod a / nebo mohou být části skvrny z kvantifikace vyloučeny) a rozdíly v softwarových algoritmech, a tedy i tendencích analýzy

Generované výběry lze použít pro automatizaci trávení v gelu proteinových skvrn a následná identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie. Analýza hmotnostní spektrometrií může identifikovat přesná hmotnostní měření spolu se sekvenováním peptidů, které se pohybují od 1000 do 4000 atomových hmotnostních jednotek. [8]Přehled současného přístupu k softwarové analýze 2DE gelových obrazů viz[9] nebo.[10]

Viz také

Reference

  1. ^ O'Farrell, PH (1975). „Dvojrozměrná elektroforéza proteinů s vysokým rozlišením“. J. Biol. Chem. 250 (10): 4007–21. PMC  2874754. PMID  236308.
  2. ^ Klose, J (1975). „Mapování proteinů kombinovanou izoelektrickou fokusací a elektroforézou myších tkání. Nový přístup k testování indukovaných bodových mutací u savců“. Humangenetik. 26 (3): 231–43. doi:10.1007 / bf00281458 (neaktivní 9. 11. 2020). PMID  1093965.CS1 maint: DOI neaktivní od listopadu 2020 (odkaz)
  3. ^ Switzer RC 3., Merril CR, Shifrin S (1979). „Vysoce citlivé stříbrné barvivo pro detekci proteinů a peptidů v polyakrylamidových gelech“. Analytická biochemie. 98 (1): 231–37. doi:10.1016/0003-2697(79)90732-2. PMID  94518.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  4. ^ Mikkelsen, Susan; Cortón, Eduardo (2004). Bioanalytická chemie. John Wiley & Sons, Inc. str.224. ISBN  978-0-471-62386-1.
  5. ^ Arora PS, Yamagiwa H, Srivastava A, Bolander ME, Sarkar G (2005). „Srovnávací hodnocení dvou dvourozměrných softwarových aplikací pro analýzu obrazu pomocí gelové elektroforézy využívajících synoviální tekutiny od pacientů s onemocněním kloubů“. J Orthop Sci. 10 (2): 160–66. doi:10.1007 / s00776-004-0878-0. PMID  15815863. S2CID  45193214.
  6. ^ Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC, et al. (Duben 2008). "Zpracování chybějících hodnot pro vícerozměrnou statistickou analýzu gelových proteomických dat". Proteomika. 8 (7): 1371–83. doi:10.1002 / pmic.200700975. hdl:1942/8262. PMID  18383008. S2CID  21152053.
  7. ^ Co chybí hodnoty a proč jsou problémem?
  8. ^ Lepedda, Antonio J a Marilena Formato. "Aplikace technologie dvourozměrné elektroforézy ke studiu aterosklerózy." EJIFCC sv. 19 316-59. 20. prosince 2008
  9. ^ Berth M, Moser FM, Kolbe M, Bernhardt J (říjen 2007). „Stav techniky v analýze obrazů dvourozměrné gelové elektroforézy“. Appl. Microbiol. Biotechnol. 76 (6): 1223–43. doi:10.1007 / s00253-007-1128-0. PMC  2279157. PMID  17713763.
  10. ^ Bandow JE, Baker JD, Berth M a kol. (Srpen 2008). „Vylepšený pracovní tok analýzy obrazu pro 2-D gely umožňuje rozsáhlé 2-D gelové proteomické studie - studie objevu biomarkerů COPD“. Proteomika. 8 (15): 3030–41. doi:10.1002 / pmic.200701184. PMID  18618493. S2CID  206361897.

externí odkazy

Prostředky knihovny o
Dvourozměrná gelová elektroforéza