SDD-AGE - SDD-AGE

Příklad výsledného Western blotu po SDD-AGE elektroforetické separaci, barvení specifickými protilátkami

SDD-AGE je zkratka pro Semi-Dnasycující Déergent AGarose Gel Elektroforéza. Toto je metoda pro detekci a charakterizaci velkých protein polymery které jsou stabilní ve 2% BL na pokojová teplota, na rozdíl od většiny velkých proteinové komplexy. Tato metoda je velmi užitečná pro studium priony a amyloidy, které se vyznačují tvorbou bílkovinné polymery.[1][2][3][4][5][6] Agaróza se používá pro gel, protože polymery odolné vůči SDS jsou velké (v rozmezí 200-4000 + kDa) a nemohou vstoupit do konvenčního polyakrylamidový gel, který má malé póry. Agaróza má na druhé straně velké póry, což umožňuje separaci polymerů.

Použití této metody umožnilo vědcům pochopit, že alespoň některé typy prionových agregátů existovaly ve dvouúrovňové struktuře - proteinové molekuly seskupeny do polymerů, které jsou velmi stabilní a vydrží zpracování 2% SDS při teplotě místnosti, a agregáty, což jsou svazky polymerů, které se za těchto podmínek disociují.

Rozdíly ve velikosti polymerů mohou naznačovat účinnost fragmentace polymeru in vivo.

Dějiny

Metoda byla vytvořena v Molekulární genetika laboratoř Ruského kardiologického výzkumného ústavu a byla publikována v roce 2003 Kryndushkinem a kol.[1] Původní metoda používala a Vyrovnávací paměť TAE systém a začlenil modifikovaný vakuový blotovací systém pro přenos proteinů na membránu (původně PVDF ). Modifikovaný vakuový blotovací systém je vlastně vakuový asistovaný kapilární přenos, protože vakuum pomáhá pouze tekutině, která již prošla gel a membrána opustit systém.

Variace

Byly také použity jiné modifikace, jako například ty, které jsou popsány v Bagriantsev et al.[7] pomocí tradičního mokrého přenosu a vyrovnávacího systému TGB a další pomocí polosuchého přenosu nebo kapilárního přenosu.[8]

DD-AGE, další variace metody, která plně využívá denaturace podmínky - včetně redukčních látek, jako jsou dithiothreitol (DTT) a tepelná denaturace při 95 ° C - je vhodná pro analýzu tepelně stabilních inkluzních tělísek polyglutaminové proteiny.[9]

Reference

  1. ^ A b Kryndushkin DS; Alexandrov IM; Ter-Avanesyan MD; Kushnirov VV (2003). „Kvasinkové [PSI +] prionové agregáty jsou tvořeny malými polymery Sup35 fragmentovanými Hsp104“. Journal of Biological Chemistry. 278 (49): 49636–43. doi:10,1074 / jbc.M307996200. PMID  14507919.
  2. ^ Salnikova AB; Kryndushkin DS; Smirnov VN; Kushnirov VV; Ter-Avanesyan MD (2005). „Potlačení nesmyslů v kvasinkových buňkách nadměrně produkujících Sup35 (eRF3) je způsobeno jeho nedědičnými amyloidy“. Journal of Biological Chemistry. 280 (10): 8808–12. doi:10,1074 / jbc.M410150200. PMID  15618222.
  3. ^ Meriin AB; Zhang X; Alexandrov IM; Salnikova AB; Ter-Avanesian MD; Černoff YO; Sherman MY (2007). „Endocytóza je zapojena do agregace proteinů s expandovanými polyglutaminovými doménami“. FASEB Journal. 21 (8): 1915–25. doi:10.1096 / fj.06-6878com. PMID  17341688.
  4. ^ Shkundina IS; Kushnirov VV; Tuite MF; Ter-Avanesyan MD (2006). „Role N-koncových oligopeptidových repetic prionového proteinu kvasinek Sup35 při šíření a přenosu prionových variant“. Genetika. 172 (2): 827–35. doi:10.1534 / genetika.105.048660. PMC  1456247. PMID  16272413.
  5. ^ Alexandrov IM; Vishnevskaya AB; Ter-Avanesyan MD; Kushnirov VV (2008). „Vzhled a propagace amyloidů na bázi polyglutaminu v kvasinkách: tyrosinové zbytky umožňují fragmentaci polymerů“. Journal of Biological Chemistry. 283 (22): 15185–92. doi:10,1074 / jbc.M802071200. PMC  2397454. PMID  18381282.
  6. ^ Alberti S; Halfmann R; Král O; Kapila A; Lindquist S (2009). „Systematický průzkum identifikuje priony a osvětluje sekvenční rysy prionogenních proteinů“. Buňka. 137 (1): 146–58. doi:10.1016 / j.cell.2009.02.044. PMC  2683788. PMID  19345193.
  7. ^ Bagriantsev SN; Kushnirov VV; Liebman SW (2006). "Analýza agregátů amyloidu pomocí elektroforézy na agarózovém gelu". Metody v enzymologii. 412: 33–48. doi:10.1016 / S0076-6879 (06) 12003-0. ISBN  9780121828172. PMID  17046650.
  8. ^ Halfmann R; Lindquist S (2008). „Screening agregace amyloidů pomocí semi-denaturující detergentní agarosové gelové elektroforézy“. Žurnál vizualizovaných experimentů (17). doi:10.3791/838. PMC  2723713. PMID  19066511.
  9. ^ Weber JJ; Golla M; Guaitoli G; Wanichawan P; Hayer SN; Hauser S; Krahl AC; Nagel M; Samer S; Aronica E; Carlson CR; Schöls L; Riess O; Gloeckner CJ; Nguyen HP; Hübener-Schmid J (2017). „Kombinatorický přístup k identifikaci míst štěpení kalpainem v proteinu ataxinu-3 u Machado-Josephovy choroby“. Mozek. 140(5): 1280-1299. doi:10.1093 / mozek / awx039. PMID  28334907.