Extrakce gelu - Gel extraction - Wikipedia

v molekulární biologie, extrakce gelu nebo gelová izolace je technika používaná k izolaci požadovaného fragmentu intaktní DNA z agarózový gel Následující elektroforéza na agarózovém gelu. Po extrakci mohou být fragmenty, které jsou předmětem zájmu, smíchány, vysráženy a enzymaticky ligovány dohromady v několika jednoduchých krocích. Tento proces se obvykle provádí dne plazmidy, je základem pro základní genetické inženýrství.

Poté, co se vzorky DNA spustí na agarózovém gelu, extrakce zahrnuje čtyři základní kroky: identifikaci požadovaných fragmentů, izolaci odpovídajících pásů, izolaci DNA z těchto pásů a odstranění doprovodných solí a barvení.

Začít, UV světlo svítí na gelu, aby osvětlil všechny ethidiumbromid - zbarvená DNA. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k vystavení DNA mutagennímu záření po dobu delší, než je nezbytně nutné. Požadovaný pás je identifikován a fyzicky odstraněn pomocí a krycí sklíčko nebo žiletka. Odstraněný plátek gelu by měl uvnitř obsahovat požadovanou DNA. Alternativní metoda využívající gelové barvení SYBR Safe DNA a osvětlení modrým světlem zabrání poškození DNA spojené s ethidiumbromidem a UV zářením.^[1]

Existuje několik strategií pro izolaci a čištění požadovaného fragmentu DNA.

Extrakce kolony odstřeďování

Soupravy pro extrakci gelu jsou k dispozici od několika hlavních výrobců biotechnologií za konečné náklady přibližně 1–2 USD na vzorek. Protokoly obsažené v těchto soupravách obecně vyžadují rozpuštění gelového řezu ve 3 objemech chaotropního činidla při 50 ° C, po kterém následuje aplikace roztoku na spinovou kolonu (DNA zůstává v koloně), 70% ethanol promytí (DNA zůstane ve sloupci, promyje se sůl a nečistoty) a eluce DNA malým množstvím (30 ul) vody nebo pufru.^[2]

Dialýza

Gelový fragment se umístí do a dialyzační trubice která je propustná pro tekutiny, ale nepropustná pro molekuly o velikosti DNA, čímž brání průchodu DNA membránou, když je nasáklá TE pufr. Kolem trubice je vytvořeno elektrické pole (způsobem podobným gelové elektrofresi) dostatečně dlouho na to, aby byla DNA z gelu odstraněna, ale zůstala v trubici. Roztok zkumavky lze poté pipetovat a bude obsahovat požadovanou DNA s minimálním pozadím.

Tradiční

Tradiční metoda gelové extrakce zahrnuje vytvoření přeložené kapsy voskového papíru Parafilm a umístění fragmentu agarózy dovnitř. Agaróza je fyzicky stlačena prstem do rohu kapsy a částečně zkapalňuje gel a jeho obsah. Kapičky kapaliny pak mohou být nasměrovány z kapsy na vnější kousek Parafilmu, kde jsou pipetovány do malé trubičky. Extrakcí butanolu se odstraní barvivo ethidiumbromid, následovaná extrakcí vyčištěného fragmentu DNA fenol / chloroformem.

Nevýhodou gelové izolace je, že pozadí lze odstranit pouze v případě, že je možné jej fyzicky identifikovat pomocí UV světla. Pokud jsou dva pásy velmi blízko u sebe, může být obtížné je oddělit bez určité kontaminace. Aby bylo možné jasně identifikovat sledované pásmo, může být nutné provést další restrikční štěpení. Omezovací místa jedinečná pro nežádoucí pásy podobné velikosti mohou pomoci při rozbíjení těchto potenciálních kontaminantů.

Reference

externí odkazy