Kvantitativní PCR přístroj - Quantitative PCR instrument - Wikipedia

A kvantitativní PCR přístroj[1] je stroj, který zesiluje a detekuje DNA. Kombinuje funkce a termální cyklovač a a fluorimetr, umožňující proces kvantitativní PCR.

První kvantitativní PCR stroj byl popsán v roce 1993,[2] a dva komerční modely byly k dispozici v roce 1996. Do roku 2009 nabídlo osmnáct různých modelů sedm různých výrobců.[3] Ceny se pohybují od přibližně 4300 USD[4] na 150 000 USD[5]

Hlavní výkonnostní dimenze kvantitativních nástrojů PCR jsou tepelná kontrola, fluorimetrie a propustnost vzorku.

Tepelná regulace

Efektivní výkon kvantitativní PCR vyžaduje rychlou, přesnou a tepelnou kontrolu.

30 cyklů PCR byly prokázány za méně než 10 minut.[6] Rychlé cyklování poskytuje několik výhod, včetně zkrácení doby do výsledku, zvýšení propustnosti systému a zlepšení specificity reakce.[7] V praxi však technické kompromisy mezi snadným použitím, rovnoměrností teploty a rychlostí znamenají, že reakční doby jsou obvykle více než 25 minut.[3]

Tepelná nerovnoměrnost během teplotního cyklování přispívá k variabilitě v PCR[8][9][10] a bohužel některé termocyklery nesplňují specifikace uváděné výrobci.[11] Zvyšování rychlosti tepelného cyklování obecně snižuje tepelnou rovnoměrnost a může snížit přesnost z kvantitativní PCR.[12]

Rovnoměrnost teploty má také přímý vliv na schopnost rozlišovat různé produkty PCR prováděním analýzy bodu tání.[13] Kromě uniformity rozlišení s nimiž jsou přístroje schopny regulovat teplotu, je faktor, který ovlivňuje jejich výkon při provádění analýzy tavení s vysokým rozlišením.[14]

Rychlost, přesnost a rovnoměrnost tepelné kontroly jsou proto důležitými výkonnostními charakteristikami kvantitativních nástrojů PCR.

Fluorimetrie

Kvantitativní přístroje PCR sledují průběh PCR a povahu amplifikovaných produktů měřením fluorescence.

Rozsah různých fluorescenčních značek, které lze monitorovat, přesnost, s jakou je lze měřit, a schopnost rozlišovat signály od různých značek, jsou relevantní výkonnostní charakteristiky.

Použitím nástroje s dostatečnými optickými kanály a rozsáhlou optimalizací testu lze v jedné reakci PCR současně kvantifikovat až 7 samostatných cílů.[15] Avšak i při rozsáhlé optimalizaci je efektivní dynamický rozsah takových multiplexních testů často snížen v důsledku interference mezi složkovými reakcemi.[16]

Šum při měření fluorescence ovlivňuje přesnost qPCR. Je to obvykle funkce změny intenzity zdroje buzení, šumu detektoru a mechanického šumu. Analýza více faktorů naznačila, že nejdůležitějším faktorem je příspěvek mechanického šumu a že systémy bez pohyblivých částí v jejich optických drahách pravděpodobně poskytnou lepší kvantitativní přesnost.[10]

Navíc při představení analýzy tavení s vysokým rozlišením, jeden faktor, který ovlivňuje citlivost heteroduplex detekce je fluorimetrická přesnost.[14]

Proto jsou počet optických kanálů a úroveň šumu ve fluorescenčních měřeních také důležitými výkonnostními charakteristikami kvantitativní PCR nástroje.

Reference

  1. ^ Někdy se také nazývá „nástroj PCR v reálném čase“.
  2. ^ Higuchi, R .; Dollinger, G .; Walsh, P.S .; Griffith, R. (1992), „Simultánní amplifikace a detekce specifických sekvencí DNA“, Bio / technologie, 10 (4): 413–7, doi:10.1038 / nbt0492-413, PMID  1368485, S2CID  1684150
  3. ^ A b Logan, J .; Edwards, K. (leden 2009). "Kapitola 2 Přehled platforem PCR". V Saunders, N. (ed.). Real-Time PCR: Aktuální technologie a aplikace. Caister Academic Press. ISBN  978-1-904455-39-4.
  4. ^ Otevřete otevřený zdroj qPCR v reálném čase PCR
  5. ^ Ma, H .; Shieh, K .; Chen, G .; Chen, X .; Chuang, M. (2006), „Aplikace polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RT-PCR)“, The Journal of American Science, 2 (3): 1–15
  6. ^ Raghavan, V .; Whitney, S .; Ebmeier, R .; Padhye, N .; Nelson, M. Viljoen; Gogos, G. (2006), „Termická analýza termocykleru založeného na vírové trubici pro rychlou amplifikaci DNA: experimentální a dvourozměrné numerické výsledky“, Přehled vědeckých přístrojů, 77 (9): 094301, Bibcode:2006RScI ... 77i4301R, doi:10.1063/1.2338283
  7. ^ Wittwer, C.T .; Garling, D.J. (1991), „Rapid cycle DNA amplification: time and temperature optimization“, Biotechniky, 10 (1): 76–83, PMID  2003928
  8. ^ Kim, Y.H .; Yang, I .; Bae, Y.S .; Park, S.R. (2008), „Hodnocení výkonu tepelných cyklovačů pro PCR v podmínkách rychlého cyklování“, Biotechniky, 44 (4): 495–6, doi:10.2144/000112705, PMID  18476814
  9. ^ Schoder, D .; Schmalwieser, A .; Schauberger, G .; Kuhn, M .; Hoorfar, J .; Wagner, M. (2003), „Fyzikální vlastnosti šesti nových termocyklů“, Clin. Chem., 49 (6): 960–3, doi:10.1373/49.6.960, PMID  12765996
  10. ^ A b Lee, D. -S. (2010). „Modelování strojního systému PCR v reálném čase a systematický přístup k robustnímu návrhu systému PCR v reálném čase na čipu“. Senzory. 10 (1): 697–718. doi:10,3390 / s100100697. PMC  3270864. PMID  22315563.
  11. ^ Schoder, D .; Schmalwieser, A .; Schauberger, G .; Hoorfar, J .; Kuhn, M .; Wagner, M. (2005), „Nový přístup k hodnocení výkonnosti cyklerů PCR použitých pro diagnostické testování“, J Clin Microbiol, 43 (6): 2724–8, doi:10.1128 / jcm. 43.6.2724-2728.2005, PMC  1151936, PMID  15956389
  12. ^ Hilscher, C .; Vahrson, W .; Dittmer, D.P. (2005), „Rychlejší kvantitativní protokoly PCR v reálném čase mohou ztratit citlivost a vykazovat zvýšenou variabilitu“, Nucleic Acids Res., 33 (21): e182, doi:10.1093 / nar / gni181, PMC  1297710, PMID  16314296
  13. ^ Herrmann, M .; Durtschi, J .; Wittwer, C .; Voelkerding, K. (2007). „Rozšířené nástrojové srovnání analýzy tání amplikonové DNA pro mutační skenování a genotypizaci“. Klinická chemie. 53 (8): 1544–1548. doi:10.1373 / clinchem.2007.088120. PMID  17556647.
  14. ^ A b Gundry, C .; Vandersteen, J .; Reed, G .; Pryor, R .; Chen, J .; Wittwer, C. (2003). „Amplikonová analýza tání se značenými primery: metoda s uzavřenou trubicí pro rozlišení homozygotů a heterozygotů“. Klinická chemie. 49 (3): 396–406. doi:10.1373/49.3.396. PMID  12600951.
  15. ^ Köppel, R .; Zimmerli, F .; Breitenmoser, A. (2009), „Heptaplex real-time PCR pro identifikaci a kvantifikaci DNA z hovězího, vepřového, kuřecího, krůtího, koňského masa, ovčího a kozího masa“, Evropský výzkum a technologie v oblasti potravin, 230: 125–33, doi:10.1007 / s00217-009-1154-5, S2CID  96340566
  16. ^ Bahrdt, C .; Krech, A .; Wurz, A .; Wulff, D. (2010). "Ověření nově vyvinutého hexaplexového testu PCR v reálném čase pro screening na přítomnost GMO v potravinách, krmivech a semenech". Analytická a bioanalytická chemie. 396 (6): 2103–2112. doi:10.1007 / s00216-009-3380-x. PMID  20101506. S2CID  22657985.

externí odkazy